一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒。所述引物为：上游引物AC1‑F和AC1‑R、AC2‑F和AC2‑R；探针为AC1 C‑P、AC1 A‑P、AC2 A‑P、和AC2 G‑P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；其中AC1‑F，AC1‑R，AC2‑F，AC2‑R，AC1 C‑P、AC1 A‑P、AC2 A‑P、和AC2 G‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1‑8所示。采用本发明专利技术的引物，探针及其试剂盒进行TP53基因SNP位点检测，具有方法简单，准确，灵敏度高，成本低，通量高，适用于一般筛查的优点。

Multiplex real-time fluorescent PCR detection primer, probe and kit for TP53 gene SNP

The invention discloses a multiplex real-time fluorescent PCR detection primer, probe and its reagent box for TP53 gene SNP site. The primers for F and AC1 primer: AC1 R, AC2 F and AC2 R; AC1 C probe P, AC1 P, AC2 A A P, G P and AC2; the probe 5 'end labeled with fluorescent groups, 3' the end labeled with quenchers; AC1 F, AC1 R, AC2 F, AC2 R, nucleotide sequence of AC1 P, AC1 C A P, AC2 A and AC2 P, G P SEQ ID NO:1 respectively as shown in 8. The SNP loci of TP53 gene are detected by the primers, probes and kits of the invention, and the method has the advantages of simple and accurate method, high sensitivity, low cost and high flux, and is suitable for the general screening.

【技术实现步骤摘要】
一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物、探针及其试剂盒。
技术介绍
恶性肿瘤已成为威胁国人健康的最重要因素，是第一死亡原因。从发病率排行看，男性发病前五位分别是肺癌、肝癌、肠癌、胃癌、泌尿生殖系癌，女性发病前五位分别为乳腺癌、肺癌、生殖系癌、肠癌、胃癌。TP53是一种肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)。该基因对人体有保护作用，它时刻监控基因的完整性，一旦细胞DNA遭到损伤，就能够阻止细胞进入DNA合成期，抑制细胞的分裂和增殖，并且使损伤的DNA修复，即使不能修复，也能够启动细胞的程序性死亡过程，防止细胞的恶性转化。研究表明，TP53基因rs12951053和rs2078486位点的多态性能够影响该基因的保护作用。肿瘤能否有效防治关键在于早期筛查并确诊，临床早期确诊的癌症5年存活率达80％-90％，随着医学技术的发展，可以预防的癌症还在增多，而TP53抑癌基因检测是目前最重要的普通人群癌症筛查方式之一。目前，用于基因筛查的常见方法是Sanger测序法，该方法能对一个样品的某一段区域进行测序，但是检测通量较低，且成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒检测成本低、通量高，适用于一般筛查。本专利技术的另一目的在于提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测方法。该方法建立在采用特殊的引物进行的多重PCR上，可以有效提高多重PCR反应的稳定性和均一性。为实现上述目的，本专利技术提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物为：上游引物AC1-F和AC1-R、AC2-F和AC2-R；，探针为AC1C-P、AC1A-P、AC2A-P、和AC2G-P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；其中AC1-F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，AC1-R的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；AC2-F的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，AC2-R的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；探针AC1C-P的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，AC1A-P的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；AC2A-P的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，和AC2G-P的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。进一步，探针的5’端的荧光基团为ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5。进一步，探针的3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、DBACYL、MGB。本专利技术还提供一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物和探针。所述引物和探针，及其所述试剂盒用于检测TP53基因SNP位点的用途。进一步，方法为，提取待测样品的DNA作为模板，以所述引物和探针或所述试剂盒进行实时荧光PCR反应；根据扩增曲线信号进行判断即可。进一步，实时荧光PCR反应的反应体系为，反应体系为：10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、2mMMgCl2、上游引物AC1-F、AC2-F各10pmol、下游引物AC1-R、AC2-R各10pmol及FAM标记的荧光探针AC1C-P、HEX标记的荧光探针AC1A-P、ROX标记的荧光探针AC2A-P、CY5标记的荧光探针AC2G-P各5pmol，模板20ng；水补足至25μL。进一步，实时荧光PCR反应的反应程序为，95℃5min；95℃20s；60℃20s；72℃20s，40个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号。本专利技术所述引物为用于扩增TP53基因rs12951053和rs2078486位点的引物，其通过在5’末端含有一段特殊的序列抑制引物二聚体的产生，可以实现稳定高效的双重PCR反应。本专利技术所述的引物由于其5’末端含有特殊序列，在扩增目的片段时如果产生了引物二聚体，会产生较稳定的发夹结构，这种结构可以抑制引物二聚体的进一步扩增，使引物二聚体保持在一个低含量的水平，从而保证特异性产物获得竞争优势。同时由于针对不同目的片度的引物都含有相同的5’末端序列，可以平衡多重PCR各个目的片段的扩增效率。最终，这种引物设计方式可以提供稳定高效的多重PCR反应。AC1：rs12951053位点AC2：rs2078486位点采用本专利技术的引物，探针及其试剂盒进行TP53基因SNP位点检测，具有方法简单，准确，灵敏度高，成本低，通量高，适用于一般筛查的优点。附图说明图1为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs12951053位点质控品作为阳性对照的检测结果图；图2为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs2078486位点质控品作为阳性对照的检测结果图；图3为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AA样本的检测结果图；图4是实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs12951053位点基因型为CC样本的检测结果图；图5是实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs12951053位点基因型为AC样本的检测结果图；图6为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GG样本的检测结果图；图7为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs2078486位点基因型为AA样本的检测结果图；图8为实施例1中本专利技术的试剂盒检测rs2078486位点基因型为GA样本的检测结果图；图9为实施例1中本专利技术的试剂盒检测纯水样本作为阴性对照的检测结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：准确性检测实验待检样本DNA的提取：用常规分子生物学方法或市售试剂盒从待检者的口腔上皮细胞提取基因组DNA。实时荧光PCR扩增与检测：反应体系为：10mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、2mMMgCl2、上游引物AC1-F、AC2-F各10pmol、下游引物AC1-R、AC2-R各10pmol及FAM标记的荧光探针AC1C-P、HEX标记的荧光探针AC1A-P、ROX标记的荧光探针AC2A-P、CY5标记的荧光探针AC2G-P各5pmol，待测样本DNA模板20ng；水补足至25μL。其中AC1：rs12951053位点AC2：rs2078486位点实时荧光PCR反应在Bio-RadCFX96仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：第一阶段：95℃5min；第二阶段：95℃20s；60℃20s；72℃20s，40个循环；在60℃退火阶段采集荧光信号；四个荧光检测通道分别为FAM、HEX、ROX、CY5。结果判读：每个SNP位点不同基因型的样品在不同的荧光检测通道都有其特征扩增曲线信号，扩增曲线信号与检测位点和检测通道的关系归纳如表1：表1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物为：上游引物AC1‑F和AC1‑R、AC2‑F和AC2‑R；，探针为AC1C‑P、AC1A‑P、AC2A‑P、和AC2G‑P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；其中AC1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，AC1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；AC2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，AC2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；探针AC1C‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；AC1A‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；AC2A‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；和AC2G‑P的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

【技术特征摘要】
1.一种TP53基因SNP位点多重实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，所述引物为：上游引物AC1-F和AC1-R、AC2-F和AC2-R；，探针为AC1C-P、AC1A-P、AC2A-P、和AC2G-P；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；其中AC1-F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，AC1-R的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；AC2-F的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，AC2-R的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；探针AC1C-P的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；AC1A-P的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；AC2A-P的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；和AC2G-P的核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。2.权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，探针的5’端的荧光基团为ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5。3.权利要求1所述的引入和探针，其特征在于，探针的3’端的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、DBACYL、MGB。4.一种TP...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱莎莎，叶国栋，陈茂立，许剑雄，徐晓政，董康梅，陈巍魏，李彬，李顺杰，
申请(专利权)人：厦门智因互联科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35