确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提出了一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，该方法包括：利用大肠杆菌特异性引物组，对所述生物制品进行实时荧光定量PCR检测，以便确定所述生物制品中大肠杆菌DNA含量。利用本发明专利技术实施例的方法，能够对生物制品中大肠杆菌DNA的含量进行定量分析，且操作简便、耗时短、灵敏度高，对生物制品中大肠杆菌DNA含量的最低检测限可达2.0fg/微升。可以为以大肠杆菌细胞为宿主的生物技术药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物技术药物的研发和安全生产提供重要支持。

Method and kit for determining content of Escherichia coli DNA in biological products

The present invention provides a method for determining the content of Escherichia coli DNA in biological products. The method comprises the following steps: using the Escherichia coli specific primer set to carry out real-time quantitative PCR detection of the biological product, so as to determine the content of Escherichia coli DNA in the biological product. The method of the present invention can be used for quantitative analysis of the content of Escherichia coli DNA in biological products, and has the advantages of simple operation, short time consuming and high sensitivity, and the minimum detection limit of Escherichia coli DNA content in biological products can be up to 2.0fg/. It can provide reliable quality control evidence for the production of biological drugs with Escherichia coli cells as host, and provide important support for the development and safety production of recombinant biotechnology drugs.

【技术实现步骤摘要】
确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法及试剂盒。
技术介绍
为了确保治疗性重组DNA药物的产品质量，欧美药监局和国家食品药品监督管理总局都对生物制品中宿主细胞DNA残留量提出了明确要求。生物制品中原核生物DNA残留量应不高于10ng/剂量，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)DNA残留量应不高于100pg/剂量。然而，如何快速、准确地检测生物制品中残留DNA仍有待进一步研究和开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出了一种能够快速、准确且高灵敏性地检测生物制品中大肠杆菌细胞DNA残留量的方法及试剂盒。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法。该方法包括：利用大肠杆菌特异性引物组，对所述生物制品进行实时荧光定量PCR检测，以便确定所述生物制品中大肠杆菌DNA含量。利用本专利技术实施例的方法，能够对生物制品中大肠杆菌DNA的含量进行定量分析，且操作简便、耗时短、灵敏度高，对生物制品中大肠杆菌DNA含量的最低检测限可达2.0fg/ul。可以为大肠杆菌细胞为宿主的生物技术药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物技术药物的研发和安全生产提供重要支持。根据本专利技术的实施例，上述确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述生物制品包括但不限于以大肠杆菌细胞为宿主的生物制品，其中包括中间过程样品、半成品、成品。根据本专利技术的实施例，所述大肠杆菌特异性引物组包括：正向引物，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，反向引物，所用反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。AGAAGCTTGCTCTTTGCTGA(SEQIDNO：1)。CTTTGGTCTTGCGACGTTAT(SEQIDNO：2)。专利技术人经过筛选实验发现，利用SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示核苷酸序列的引物组，对生物制品中大肠杆菌DNA含量检测的灵敏性和特异性显著提高。根据本专利技术的实施例，在实时荧光定量PCR检测的反应体系中，所述正向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；所述反向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；以及所述引物组的浓度为0.4～2.0微摩尔/升，优选为0.8微摩尔/升。根据本专利技术的实施例，专利技术人经过筛选实验发现，所述引物组的浓度以及所述正向引物和所述反向引物的浓度在上述范围内，引物对模板DNA的特异性结合能力显著提高，扩增产物的特异性显著提高。根据本专利技术的实施例，所述确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法进一步包括：将所述生物制品用超纯水稀释,以便获得待测样品，所述待测样品的浓度为50pg/微升～200pg/微升，优选为100pg/微升。专利技术人经过大量的筛选实验发现，待测样品在超纯水中的浓度高于200pg/微升，待测样品中非DNA成分对实时荧光定量PCR检测造成显著干扰，所得结果的真实性和准确性显著降低，待测样品在超纯水中的浓度低于50pg/微升，则待测样品中模板DNA量过低，造成荧光定量PCR检测结果重复性和准确度较差，而造成判断失误。而待测样品的浓度在100pg/微升，检测结果最接近生物样品中DNA的实际含量。所述待测样品在50pg/微升～200pg/微升的浓度范围内，检测结果的准确度以及检测的灵敏度均显著提高。根据本专利技术的实施例，所述确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法还可以进一步包括：利用大肠杆菌细胞基因组DNA标准品构建CT-DNA量标准曲线，并将所述待测样品中大肠杆菌细胞DNA的CT值与所述标准曲线对比，确定所述待测样品中大肠杆菌DNA含量，其中，所述CT值是通过利用实时荧光定量PCR技术检测大肠杆菌细胞DNA获得的。构建CT-DNA量标准曲线以及将待测样品中大肠杆菌细胞DNA的CT值与标准曲线对比来确定待测样品中大肠杆菌的含量，使得本专利技术实施例所提出的检测方法的稳定性和准确度显著提高。根据本专利技术的实施例，所述大肠杆菌细胞基因组DNA标准品的浓度为2×108fg/微升、2×107fg/微升、2×106fg/微升、2×105fg/微升、2×104fg/微升、2×103fg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升。根据本专利技术的实施例，所述大肠杆菌细胞基因组DNA标准品的浓度是专利技术人基于生物制品中大肠杆菌DNA的一般含量确定的，专利技术人经过大量的筛选实验发现，在上述标准品的浓度范围和梯度下，所得标准曲线更加适用于确定生物制品中大肠杆菌DNA的含量，进而使得本专利技术实施例所述提出检测方法的检测结果的准确度进一步提高。具体地，在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法。该方法包括：(1)将所述生物制品用超纯水稀释,以便获得待测样品，所述待测样品的浓度为50pg/微升～200pg/微升，优选为100pg/微升；(2)利用实时荧光定量PCR技术确定所述待测样品中大肠杆菌细胞DNA的CT值，其中所述实时荧光定量PCR技术的反应体系包括8.5微升Milli-Q超纯水、1微升浓度为10微摩尔/升的正向引物、1微升浓度为10微摩尔/升的反向引物、12.5微升SYBRMIX和2微升所述待测样品，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；其中所述实时荧光定量PCR技术的反应条件为95℃30s；95℃05s，54℃30s，72℃35s循环数40；(3)利用大肠杆菌细胞基因组DNA标准品构建CT-DNA量标准曲线，并将所得到的待测样品中大肠杆菌细胞DNA的CT值与所述标准曲线对比，确定所述待测样品中大肠杆菌细胞DNA的含量，其中，所述大肠杆菌细胞基因组DNA标准品的浓度为2×108fg/微升、2×107fg/微升、2×106fg/微升、2×105fg/微升、2×104fg/微升、2×103fg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升。利用根据本专利技术实施例的方法，能够对生物制品中大肠杆菌DNA的含量进行定量分析，且操作简便、耗时短、灵敏度高，对生物制品中大肠杆菌DNA含量的最低检测限可达2.0fg/微升。可以为大肠杆菌细胞为宿主的生物技术药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物技术药物的研发和安全生产提供重要支持。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了实时荧光定量PCR技术在检测生物制品中大肠杆菌细胞DNA含量中的用途。本专利技术实施例所提出的确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，将实时荧光定量PCR技术应用于检测生物制品中的大肠杆菌DNA含量，克服了生物制品的成分复杂易干扰实时荧光定量PCR反应的缺陷，检测结果接近生物样品中大肠杆菌DNA的真实含量，检测结果准确度高，实现了对生物制品中大肠杆菌DNA的实时定量分析和监控。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括：正向引物，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；反向引物，所述反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，其特征在于，包括：利用大肠杆菌特异性引物组，对所述生物制品进行实时荧光定量PCR检测，以便确定所述生物制品中大肠杆菌DNA含量。

【技术特征摘要】
1.一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，其特征在于，包括：利用大肠杆菌特异性引物组，对所述生物制品进行实时荧光定量PCR检测，以便确定所述生物制品中大肠杆菌DNA含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌特异性引物组包括：正向引物，所述正向引物具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，反向引物，所用反向引物具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在实时荧光定量PCR检测的反应体系中，所述正向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；所述反向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；以及所述引物组的浓度为0.4～2.0微摩尔/升，优选为0.8微摩尔/升。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将所述生物制品用超纯水稀释,以便获得待测样品，所述待测样品的浓度为50pg/微升～200pg/微升，优选为100pg/微升。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括：利用大肠杆菌细胞基因组DNA标准品构建CT-DNA量标准曲线，并将所述待测样品中大肠杆菌细胞DNA的CT值与所述标准曲线对比，确定所述待测样品中大肠杆菌DNA含量，其中，所述CT值是通过利用实时荧光定量PCR技术检测大肠杆菌细胞DNA获得的。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌细胞基因组DNA标准品的浓度为2×108fg/微升、2×107fg/微升、2×106fg/微升、2×105fg/微升、2×104fg/微升、2×103fg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升。7.一种确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学海，周昌茂，许勇，马铮，黄璐，马梵辛，肖强，刘哲，
申请(专利权)人：武汉光谷人福生物医药有限公司，湖北生物医药产业技术研究院有限公司，人福医药集团股份公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42