猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法技术方案

本发明专利技术以GenBank中登陆的猪带绦虫

System analysis method of stability of expression of Taenia solium recombinant Lactococcus lactis

The present invention is a Taenia solium landed in GenBank

【技术实现步骤摘要】
猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法
本专利技术涉及猪带绦虫重组活疫苗研究领域，具体为猪带绦虫TSOL18基因重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法。
技术介绍
猪囊尾蚴病(cysticercosiscellulosae)俗称猪囊虫病(bladderdisease)，是由猪带绦虫(Taeniasolium,Ts)的中绦期幼虫猪囊尾蚴(cysticercuscellulosae)引起的一种严重危害畜牧业生产和人类健康的人兽共患寄生虫病，是国家卫生部规划防治的重点寄生虫病之一。本病呈世界性分布，主要流行于中非、南非、拉丁美洲、东亚和南亚等经济、卫生条件差的国家及地区。我国主要流行于黑龙江、吉林、云南、河南、河北、山东和广西等31个省市自治区。据近年普查，我国猪带绦虫的感染率为0.112％，局部地区高达0.66％～6.00％，感染人数126万，囊虫的感染率为0.14％～3.20％，感染人数300万。其中2.3％～25.0％的猪带绦虫病患者由于自身感染而伴有囊虫的寄生。因此研发安全高效的疫苗防治该病意义重大。TSOL18基因相对保守，存在于激活的TSO中，具有良好的免疫原性和抗原性，被认为是最具发展前途的侯选疫苗基因。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)是LAB中最重要的模式菌，应用范围于食品、医药领域密切相关。随着基因工程技术的发展，选择具有高效、无毒副作用的L.lactis作为载体，已在细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等领域构建了一系列基因工程疫苗。就上述背景
而言，尚未见猪带绦虫重组L.lactis的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法。为达到上述目的，采用的技术方案为：猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法，根据猪带绦虫TSOL18基因序列，分别合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因，进行重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18的构建以及猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis和pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建；分析方法包含以下步骤：1)、将获得的含有目的基因的质粒分别在含红霉素的GM17液体培养基与不含红霉素的GM17液体培养基中，30℃培养24h后，4℃放置过夜并保种；2)、分别取步骤1)培养物进行划线接种于GM17平板，30℃培养24h后，在划线平板上分别挑取100个单菌落接种于相应含红霉素的培养基与不含红霉素的培养基中，30度培养24h后计数生长菌落；3)、重复操作传至20代；4)、根据100个单菌落接种于红霉素平板的菌落生长数，计算其质粒的其遗传稳定性。本专利技术以GenBank中登陆的猪带绦虫TSOL18基因序列为模板，以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis,L.lactis)MG1363为宿主系统进行基因优化，通过基因合成的方式，合成目的基因TSOL18，双酶切连接至pMG36e载体，分别构建分泌型表达载体pMG36e-SP-TSOL18和胞内型表达载体pMG36e-TSOL18，酶切和测序鉴定；再将其电穿孔转化至L.lactisMG1363，成功构建猪带绦虫乳酸乳球菌表达系统pMG36e-SP-TSOL18/L.lactisMG1363和pMG36e-TSOL18/L.lactisMG1363。进行PCR鉴定，SDS-PAGE和Westernblot分析TSOL18在胞内检测到目标蛋白表达，胞外未检测到目标蛋白，而SP-TSOL18在胞内与胞外均有目标蛋白表达；通过AKTA蛋白纯化鉴定及稳定性分析，pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18质粒在L.lactisMG1363中连续传代20代，均有较好的遗传稳定性。为猪囊尾蚴病疫苗的开发与利用提供了有力的参考依据。附图说明图1为猪带绦虫TSOL18基因序列的原始序列码；图2为猪带绦虫TSOL18基因序列的优化后序列码；图3为猪带绦虫TSOL18基因序列的原始GC含量图；图4为猪带绦虫TSOL18基因序列的优化后GC含量图；图5为TSOL18基因部分序列比对结果图；图6为SP-TSOL18基因部分序列比对结果图；图7为重组质粒pMG36e-TSOL18双酶切鉴定图；图8为重组质粒pMG36e-SP-TSOL18双酶切鉴定图；图9为乳球菌MG1363阳性克隆子提取基因组DNA测定图；图10为PCR鉴定TSOL18阳性克隆子图；图11为PCR鉴定SP-TSOL18阳性克隆子图；图12为TSOL18菌株表达鉴定分析结果图；图13为SP-TSOL18菌株表达鉴定分析结果图；图14为TSOL18蛋白纯化鉴定图；图15为SP-TSOL18蛋白纯化鉴定图；图16为纯化后TSOL18蛋白的Westernblot鉴定图；图17为纯化后SP-TSOL18蛋白的Westernblot鉴定图；图18为TSOL18质粒鉴定结果图；图19为SP-TSOL18质粒鉴定结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图进一步介绍本专利技术，但本专利技术不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。1目的基因分析根据猪带绦虫TSOL18基因序列(登录号：AF017788.1)，对目的基因进行分析和优化。2TSOL18基因合成和引物设计采用基于PAS(PCR-basedAccurateSynthesis)的方法，在引物的两端各设计了SacI和HindIII酶切位点和保护性碱基，由南京钟鼎生物实验室分别合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因。3重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18的构建及鉴定合成的目的基因与表达载体pMG36e用SacI/HindIII双酶切相连接，获得重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18，转化至Top克隆菌株，抽提阳性质粒测序鉴定。4猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis、pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建及鉴定4.1乳球菌的活化及感受态制备取乳酸球菌MG1363菌液接种于GM17固体培养基平板，在不通风的条件下，30度培养过夜，培养至OD值为0.2-0.8，培养结束后将培养物冰浴10min，离心收集菌体，用冰冷的甘油磷酸缓冲液洗涤菌体，然后用1:100的甘油磷酸缓冲液重悬菌体，可见细小的圆形白色不透明菌落出现，菌落边缘呈明显的不光滑形状，从形态上与乳酸杆菌培养吻合。4.2重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18电转化MG1363分别将获得的pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18质粒与感受态MG1363混合，冰浴10min，电击。电转参数如下：电压2000V，电容25UF，电阻200Ω，进行第一次脉冲，然后立即加入900ul低温的蔗糖MRS培养基，冰上放置10min，期间不要振动，30℃复苏培养2-3h，将菌液3000g离心弃去上清后浓缩于100ul蔗糖MRS培养基中，将其涂布在10ug/ml的红霉素GM17平板上，培养2-3d。期间保持相对密闭环境，观察菌落生长情况，一周左右本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法，根据猪带绦虫TSOL18基因序列，分别合成TSOL18和SP‑TSOL18目的基因，进行重组质粒pMG36e‑TSOL18和pMG36e‑SP‑TSOL18的构建以及猪带绦虫重组pMG36e‑TSOL18/L.lactis和pMG36e‑SP‑TSOL18/L.lactis的构建；其特征是，分析方法包含以下步骤：1)、将获得的含有目的基因的质粒分别在含红霉素的GM17液体培养基与不含红霉素的GM17液体培养基中，30℃培养24h后，4℃放置过夜并保种；2)、分别取步骤1)培养物进行划线接种于GM17平板，30℃培养24h后，在划线平板上分别挑取100个单菌落接种于相应含红霉素的培养基与不含红霉素的培养基中，30度培养24h后计数生长菌落；3)、重复操作传至20代；4)、根据100个单菌落接种于红霉素平板的菌落生长数，计算其质粒的其遗传稳定性。

【技术特征摘要】
1.猪带绦虫重组乳酸乳球菌表达系统的稳定性分析方法，根据猪带绦虫TSOL18基因序列，分别合成TSOL18和SP-TSOL18目的基因，进行重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18的构建以及猪带绦虫重组pMG36e-TSOL18/L.lactis和pMG36e-SP-TSOL18/L.lactis的构建；其特征是，分析方法包含以下步骤：1)、将获得的含有目的基因的质粒分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：周必英，孙俊超，李想，罗波，江楠，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52