一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种烟草腋芽生长调控基因

A tobacco axillary bud growth of NtMAX3 gene and cloning method and application of 2

The present invention discloses a tobacco axillary bud growth regulating gene

【技术实现步骤摘要】
一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用
本专利技术属于遗传工程
，具体涉及一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用。
技术介绍
烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。打顶抹芽是优质烤烟种植过程中一项重要的生产技术措施。烟草在一定的生长时期必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养，会降低烟叶的品质和产量，因此必须抹掉侧芽。人工抹芽耗费人力和物力，增加烟叶生产成本；打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，降低烟叶生产劳动强度，但化学药剂需要成本，且会造成环境污染。以发现打顶后产生侧芽（腋芽）的相关基因为突破口，通过生物技术创建无侧芽、少侧芽或小侧芽的烟草，则有可能从根本上或大幅度解决上述问题，从而实现烟草生长量、烟叶品质、环保等方面均有较大提升和改善。MAX3是独脚金内酯合成途径基因。其在控制分枝生长中的功能已有报道，拟南芥MAX3基因突变后分枝增加。我们对烟草NtMAX3-2基因也进行了广泛理论研究和应用实践，发现过表达NtMAX3-2在烟草打顶后具有抑制侧芽（腋芽）形成的功能。通过植物基因工程技术控制烟草腋芽形成具有生产应用重要意义。国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术对烟草无腋芽、少腋芽品种进行研究，以提高烟草品质，减少对烟草打顶后化学药剂的施用，以降低烟叶生产劳动强度、化学药剂成本和环境污染。目前，我国也提出了无腋芽优质烟的开发计划，为烟草无腋芽、少腋芽品种研究提供了契机。随着烟草无腋芽、少腋芽品种研究的深入，必将使我国烟草腋芽控制迈上新台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种调控腋芽生长的候选基因，通过基因操作减少烟草腋芽是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2；第二目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：A、确定NtMAX3-2基因序列；（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。本专利技术的第三目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。本专利技术利用同源克隆技术从烟草中得到一个烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2，具体步骤为：根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtMAX3-2基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtMAX3-2基因的过表达（OE）植株，对NtMAX3-2进行功能鉴定，结果表明NtMAX3-2基因具有抑制烟草腋芽形成的功能。NtMAX3-2基因的发现，为通过调控基因的表达抑制打顶后烟草腋芽的形成提供了基因资源。附图说明图1为中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建；其中：A为利用引物对NtMAX3-2F/NtMAX3-2R扩增NtMAX3-2基因结果，M:DL2,000DNAMarker，1～2:PCR扩增产物；B为pTOPO-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测，M:DL2,000DNAMarker，1、4～5:PCR扩增产物；C为KpnI＋XhoI双酶切检测pTOPO-NTMAX3-2质粒，M:DL2,000，1～3:酶切产物；图2为入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2的构建；其中：A为pENTR™2B-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测,M:DL2,000DNAMarker，1～5:PCR扩增产物；B为KpnI＋XhoI双酶切检测pENTR™2B-NTMAX3-2质粒，M:DL2,000，3～5:酶切产物；图3为植物表达载体pK2-NTMAX3-2的构建，pK2-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测，M:DL2,000DNAMarker，1～2:PCR扩增产物；图4为菌落PCR检测pK2-NTMAX3-2的农杆菌转化效果；图5为NtMAX3-2T1代过表达株系基因表达水平分析；图6为NtMAX3-2T1代过表达株系腋芽重量分析；图7为NtMAX3-2T1代过表达株系腋芽长度分析；图8为NtMAX3-2T2代过表达株系腋芽重量分析。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法，包括以下步骤：A、确定NtMAX3-2基因序列；（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草腋芽生长调控基因

【技术特征摘要】
1.一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2，其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2，其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种权利要求1所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：A、确定NtMAX3-2基因序列；（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×PhusionHF反应缓冲液10μL，10mMdNTP1μL，2U的Phusion®High-FidelityDNAPolymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL,PCR反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μLsaltsolution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。4.根据权利要求3所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法，其特征在于C步骤中所述的特异性引物为：正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’。5.根据权利要求3所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法，其特征在于D步骤中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl10g溶解于1L蒸馏水中，121中灭菌25min得到。6.一种权利要求1或2所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用，其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。7.根据权利要求6所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用，其特征在于所述获得的NtMAX3-2过表达的转基因烟草的方法包括以下步骤：A、中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用NtMAX3-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为2kb的基因片段；（2）将回收的NtMAX3-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，扩增产物大小约为2kb，和预期相符，说明pTOPO-N...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙武，高玉龙，李文正，宋中邦，李梅云，李永平，王燃，罗朝鹏，曾建敏，刘勇，黄昌军，吴兴富，徐向丽，张晨东，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53