EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域，公开了一种影响水稻种子萌发发育的

Application of EMP gene in Seed Germination and development of rice

The invention belongs to the field of plant gene engineering, and discloses a kind of influence on the germination and development of rice seeds

【技术实现步骤摘要】
EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用
本专利技术属于植物基因工程
，更具体地，涉及一种EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用。
技术介绍
水稻种子的发芽过程可分为三个阶段：1．吸胀阶段：水稻种子胚乳中的淀粉、蛋白质等物质吸水膨胀，酶开始活动，呼吸作用加强，同时贮藏物质开始转化和运输。2．萌动阶段：随着稻种吸胀和含水量增加，种子代谢活动旺盛，胚乳养分被分解成简单的可溶性物质，同时胚吸收这些被分解的物质，形成新的复杂的有机物，构成新细胞，使细胞数目增多，体积增大。胚的体积增大到一定程度，突破种皮外露。3.发芽阶段：种子露白后，胚继续生长，当胚根伸长到与种子等长，胚芽伸长到种子长度的一半时，称为发芽。水稻种子的萌发特性如发芽能力、萌发速率与整齐度直接影响到种子播种质量、幼苗建成甚至最终的产量形成。不同水稻品种存在广泛的萌发特性的差异，其中，籼粳亚种间的差异比较明显，籼稻的萌发速率要快于粳稻。因此鉴定分析影响水稻种子萌发相关基因功能对于了解水稻种子萌发机理和降低农业生产中种子萌发率导致产量下降的风险有很大的意义，同时对培育水稻新品种也具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案给予实现的：本专利技术通过构建水稻Os05g0349800序列所示基因的RNA干涉载体并转化水稻中花11，获得反向遗传学突变体材料；将影响水稻种子萌发发育的RNA干涉突变体材料与野生型水稻中花11种子分别诱导水稻种子萌发，并统计分析种子萌发发育能力显著差异，结果发现，Os05g0349800序列所示基因为影响水稻种子萌发发育的基因；若水稻中该基因被破坏或不表达，即可导致水稻种子萌发再生能力下降。所述基因的序列如SEQIDNO：1所示，其编码氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，所述蛋白为一个10.1kD小分子量蛋白；比对发现其为水稻EMP基因，现有中仅公开了其与水稻渗透胁迫、盐胁迫和干旱胁迫的耐受性有关，除此之外的其他功能还未见报道。因此，本专利技术首先保护EMP基因及其编码蛋白在如下几个方面的应用：SEQIDNO：1所述的EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用。SEQIDNO：2所述蛋白在水稻种子萌发发育中的应用。优选地，所述应用为提高或减缓水稻种子萌发发育水平。具体地，所述应用为构建过量表达SEQIDNO：1所述基因的重组表达载体，并转化水稻植株；或构建SEQIDNO：1所述基因的沉默载体，并转化水稻植株。优选地，所述沉默载体为RNA干扰载体。优选地，所述RNA干扰载体的两个DNA片段的扩增引物依次如SEQIDNO：3～6所示。SEQIDNO：3CTAGTCGACTCTAGCCTCGAGATGGCGTCCGGGCAGCAGSEQIDNO：4ATCTGCTCCTTCCTCGTCTSEQIDNO：5GGAGGCCTGGATCGACTAGTATGGCGTCCGGGCAGCAGSEQIDNO：6AGACGAGGAAGGAGCAGATCTCGGCGAGGTTCTCCTG优选地，所述转化为农杆菌介导转化法。SEQIDNO：1所述的EMP基因在鉴别水稻种子萌发发育水平中的应用。具体地，所述应用为检测水稻品种中SEQIDNO：1所示EMP基因的表达水平，若EMP基因表达水平高，则表示该水稻品种的种子萌发发育水平高，反之则表示该水稻品种的种子萌发发育水平低。优选地，所述EMP基因的实时定量RT-PCR引物如SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示，内参基因OsActin1的扩增引物如SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，SEQIDNO：9：5’-CACATTCCAGCAGATGTGGA-3’SEQIDNO：10：5’-ACCACAGGTAGCAATAGGTA-3’SEQIDNO：11：5’-TCATATGGTGATGCGTGCTT-3’SEQIDNO：12：5’-AAGAAGCTAGCAGCTGCTG-3。优选地，所述检测反应体系为：2×SYBRGreen染料定量PCR反应液10μL，无菌水8.6µL，10µmol/L上下游引物各0.2µL，模板为1µL，总体积20μL。优选地，反应程序为（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；（iii）72℃延伸5min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的EMP基因与水稻种子萌发发育相关，通过检测EMP基因的表达量，可以快速检测鉴定水稻品种种子萌发发育水平；同时，过表达EMP基因，可提高水稻种子萌发发育水平，改良水稻种子萌发能力，培育新的水稻品种，也可减少或沉默水稻中EMP基因的表达，从而减缓其种子萌发能力，适用于种子贮藏，具有较大的应用前景。附图说明图1为中花11和RNA干涉突变体诱导种子萌发时期的基因表达水平的RT-PCR结果图；其中，ZH是指野生型水稻中花11，EMPi是指雌激素诱导型RNAi干涉转基因植株；+ER指加入诱导剂雌激素ER处理。图2为中花11和RNA干涉突变体的种子萌发能力差异结果图；其中，ZH是指野生型水稻中花11，EMPi是指雌激素诱导型RNAi干涉转基因植株；+ER指加入诱导剂雌激素ER处理。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1水稻影响种子萌发能力相关基因EMP的RNA干涉突变体材料的获得根据NCBI数据库Os05g0349800序列信息设计特异引物：SEQIDNO：3：ctagtcgactctagcctcgagATGGCGTCCGGGCAGCAGSEQIDNO：4：ATCTGCTCCTTCCTCGTCTSEQIDNO：5：ggaggcctggatcgactagtATGGCGTCCGGGCAGCAGSEQIDNO：6：agacgaggaaggagcagatCTCGGCGAGGTTCTCCTG利用引物SEQIDNO：3和SEQIDNO：4组合以及SEQIDNO：5和SEQIDNO：6组合扩增两个DNA片段后利用一步构建RNA干涉载体方法（Jiang,etal.,Planta.2013.(238)：325-330）构建pER8雌激素诱导型RNA干涉载体（ZuoJ,etal.,2000.11(2):146-151.）。通过农杆菌介导转化方法转化中花11，获得稳定的转基因株系，该转基因株系的种子萌发能力与中花11相比显著下降，因此该转基因株系即影响种子萌发能力相关基因EMP的RNA干涉突变体材料。实施例2水稻影响种子萌发能力相关基因功能鉴定1、水稻RNA的提取和反转录反应（1）取水稻（中花11）组织约0.5g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末后，放入2mL离心管中，加入1000μLRNA提取缓冲液和200μL氯仿，混匀，65℃水浴5min；（2）在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心1本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO：1所述的

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO：1所述的EMP基因在水稻种子萌发发育中的应用。2.SEQIDNO：2所述蛋白在水稻种子萌发发育中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为提高或减缓水稻种子萌发发育水平。4.SEQIDNO：1所述的EMP基因在鉴别水稻种子萌发发育水平中的应用。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建过量表达SEQIDNO：1所述基因的重组表达载体，并转化水稻植株。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建SEQIDNO：1所述基因的沉默载体，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：张群宇，贾春阳，周峰，刘耀光，王曼，江燕翔，赵秀彩，谢敏，祝钦泷，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44