使用CRISPR技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种利用CRISPR‑Cas9特异敲除microRNA‑8086基因的方法，所述方法为：（1)构建Cas9表达载体；(2构建sgRNA表达载体;(3)将Cas9、sgRNA‑混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将microRNA‑8086基因定点敲除的目的。

Application of CRISPR technique in coronary atherosclerotic heart disease

The invention provides a knock out microRNA 8086 gene by CRISPR specific Cas9, the method is as follows: (1) to construct a Cas9 expression vector to construct sgRNA expression vector; (2; (3) Cas9, sgRNA mixed into mixed liquid, injection of mammalian animal fertilized eggs, microRNA will achieve 8086 the purpose of gene knockout.

【技术实现步骤摘要】
使用CRISPR技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
本专利技术涉及CRISPR技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用，属于医药生物

技术介绍
冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。但是冠心病的范围可能更广泛，还包括炎症、栓塞等导致管腔狭窄或闭塞。世界卫生组织将冠心病分为5大类：无症状心肌缺血(隐匿性冠心病)、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心脏病)和猝死5种临床类型。临床中常常分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征。在临床表现上主要体现在典型胸痛。因体力活动、情绪激动等诱发，突感心前区疼痛，多为发作性绞痛或压榨痛，也可为憋闷感。疼痛从胸骨后或心前区开始，向上放射至左肩、臂，甚至小指和无名指，休息或含服硝酸甘油可缓解。胸痛放散的部位也可涉及颈部、下颌、牙齿、腹部等。胸痛也可出现在安静状态下或夜间，由冠脉痉挛所致，也称变异型心绞痛。如胸痛性质发生变化，如新近出现的进行性胸痛，痛阈逐步下降，以至稍事体力活动或情绪激动甚至休息或熟睡时亦可发作。疼痛逐渐加剧、变频，持续时间延长，祛除诱因或含服硝酸甘油不能缓解，此时往往怀疑不稳定心绞痛。目前，治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病主要使用抗心绞痛药物，比如硝酸酯类，肾上腺素β受体阻断药，钙通道阻滞剂等。CN105816722A中公开了一种治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的中药制剂，其原料药包括川芎、桃仁、红花、赤芍、当归、土鳖虫、九香虫、川牛膝、红曲、生山楂、雄黑豆、穿山甲、延胡索、醋香附、银杏叶、降香、茯神、远志、乌枣、甘松、琥珀、五爪龙、柴胡、葛根、桔梗、乌贼鱼墨囊。该中药制剂针对病因病机组方用药，具有辨证论治的优势，克服了传统西药无法区分证型进行对证治疗，通过中药的内服，可以在一定程度上替代西药的使用，降低药物依赖性及副作用等。CN101332246B中公开了治疗冠心病和心绞痛的中药制剂，主要包括丹参18-22、三七4-6、赤芍17-23、降香13-18、元胡13-18、红花7-11、何首乌18-22、鸡血藤25-35、没药18-22、人参13-17、肉桂13-17、淫羊藿18-22、鹿茸4-6、灵芝11-15、冬虫夏草7-9、川芎12-18、桃仁8-12、乳香13-17、全蝎4-6、蜈蚣4-6、丹皮12-17等组分，根据实验结果来看具有一定的效果。在现有技术中，CN103877576B中公开了以Card3基因敲除小鼠和心脏特异性Card3转基因小鼠为对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与WT小鼠对比，Card3基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；CN103893743B中以GDF1基因敲除小鼠和心脏特异性GDF1转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支造成心肌梗死模型进行研究，结果表明与MEM-Cre对照小鼠对比，GDF1基因敲除小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显增加，心功能明显恶化；而心脏特异性GDF1转基因小鼠的心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显改善。CN103898189B中公开了以SHPS-1基因敲除小鼠和心脏特异性SHPS-1转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死模型，结果表明与WT对照小鼠对比，SHPS-1基因敲除小鼠在MI术后心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转；CN103893763B中公开了以Vinexin-β基因敲除小鼠和心脏特异性Vinexin-β转基因小鼠为实验对象，通过阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死模型，结果表明与WT对照小鼠对比，Vinexin-β基因敲除小鼠在MI术后心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显被抑制，心功能明显好转。通过以上结果可以发现，通过基因干扰可以实现冠状动脉粥样硬化性心脏病的治疗。目前，规律成族间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除。这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一。Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA--crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术。与ZFN和siRNA相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。
技术实现思路
根据第一方面，本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供微小核苷酸miR-8086采用CRISPR/Cas9系统敲除的目的。这是首次利用CRISPR/Cas9系统特异性的将micrRNA家族的miR-8086进行敲除。利用这种新的方法可高效的实现miR敲除的目的。本专利技术另外一方面，根据申请人前期通过筛选获得miR-8086与Card3和SHPS-1的正向表达调节关系，提供了miR-8086的敲除后抑制Card3和SHPS-1基因的表达，从而治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。本专利技术另外提供一种sgRNA，其序列为根据miR-8086前体序列，通过前期40多个设计的sgRNA靶点中通过初步试验找到的唯一一个具有较好敲除效果的sgRNA，其序列如gcacagccttggtgtctctagtcc(SEQIDNO：1所示)。本专利技术提供一种利用CRISPR-Cas9特异敲除microRNA基因的方法，所述方法为：(1)构建Cas9表达载体；(2构建sgRNA表达载体；(3)将Cas9、sgRNA-混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将microRNA基因定点敲除的目的。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：1)基因修饰效率较高，降低了传统技术的不可靠性；2)操作技术简单，无需通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤；3)通过简单的一步即可实现复杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR‑8086在制备下调Card3和SHPS‑1基因表达的试剂中的应用；其中所述试剂能够治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。

【技术特征摘要】
1.miR-8086在制备下调Card3和SHPS-1基因表达的试剂中的应用；其中所述试剂能够治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病。2.miR-8086的敲除试剂在制备用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的药物的用途。3.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯冬雪，万埝，
申请(专利权)人：侯冬雪，
类型：发明
国别省市：河南,41