一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了属于基因工程和生物化工领域的一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。该高产透明质酸的基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。本发明专利技术中的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物；高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的透明质酸产量高，高达22g/L以上，为现有工业生产水平的3倍，新菌株具有良好的产业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程和生物化工及微生物发酵领域，具体涉及一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid,HA)是一类广泛存在于人和动物体内的酸性粘多糖，其分子结构是由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronicacid,GlcA)和N-乙酰-氨基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)交替线性共聚而成，分子量可达105～107Da。在人体内，透明质酸主要起着润滑、促进伤口愈合、调节结缔组织通透性等作用。临床上，透明质酸广泛用于眼科手术和关节炎手术，以及药物递送。由于透明质酸可以吸收自身重量1000倍的水分，故在化妆品中常被用作保湿因子。小分子透明质酸则可以作为口服保健品，来增强细胞新陈代谢，预防衰老。20世纪80年代之前，透明质酸的来源主要是生物组织提取法，原料为雄公鸡的鸡冠，产量很低；同时产品中会残留有动物源蛋白，对一些蛋白过敏人群而言有一定的安全隐患。随着微生物技术的发展，我国生产透明质酸的方法主要是微生物发酵法。常用的生产菌株为兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等动物致病菌(中国专利技术专利ZL94104439.4，制备透明质酸的微生物、培养基和方法)，透明质酸的产量一般为4～7g/L。国外同样也利用链球菌进行透明质酸的发酵生产(KimJH,YooSJ,KweonYG,SelectionofaStreptococcusequimutantandoptimizationofcultureconditionsfortheproductionofhighmolecularweighthyaluronicacid,EnzymeMicrobiol.Technol,1996,19:440-445)。链球菌发酵生产的营养要求较高，培养基中的血清、脑心浸取液等原料价格昂贵，工业生产的成本高；另一方面，由于链球菌株具有一定的致病风险，透明质酸生产的安全性需求限制了它的发展。开发研究新的更加安全且经济可行的基因重组菌发酵工艺逐渐被重视。透明质酸的重组合成需要引入透明质酸合成酶。中国专利技术专利ZL98812773.3于2001年公开了“透明质酸合成酶基因及其应用”。丹麦Novozyme公司考察了来自不同链球菌种属的透明质酸合成酶基因，并开发了基于重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的透明质酸生产工艺，其最优产量可以达到链球菌的生产水平(WidnerB,BehrR,VonDollenS,HyaluronicacidproductioninBacillussubtilis,ApplEnvironMicrobiol,2005,71(7):3747-52)，并申请了中国专利“低分子量透明质酸的产生”(CN101384724A)。Yu等人则着眼于在革兰氏阴性菌重组大肠杆菌(Escherichiacoli)中发酵生产透明质酸的可行性，结果表明操纵子选择、稀有密码子效应、细菌生长抑制等因素均会影响透明质酸的产量和分子量(YuH,StephanopoulosG,MetabolicengineeringofEscherichiacoliforbiosynthesisofhyaluronicacid,MetabEng.,2008,10(1):24-32)。Kaur等人于在2016年通过基因工程和代谢工程手段成功构建了基因重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，透明质酸积累量达3.03g/L(Kaur,M.,Jayaraman,G.,Hyaluronanproductionandmolecularweightisenhancedinpathway-engineeredstrainsoflactatedehydrogenase-deficientLactococcuslactis.Metab.Eng.Commun.2016,3:15-23.)。谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是一类好氧细菌，细胞呈短杆或小棒状，为革兰氏阳性。2003年，谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组测序工作完成(http://gib.genes.nig.ac.jp/)。谷氨酸棒杆菌作为美国食品药物管理局认定的GRAS(一般认为安全)菌株，长期被应用于氨基酸或食品添加剂的生产。其本身不分泌任何内毒素和外毒素的特点保证了其分泌产品符合食品安全和医药产品安全标准。于慧敏等人于2014年成功构建了可以生产透明质酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其产量达6.0g/L以上(CN103937734A)。陈振等人则在重组谷氨酸棒杆菌中，通过阻断磷酸戊糖途径，使中等分子量的透明质酸产量达到9.6g/L(CN106190939A)。
技术实现思路
本专利技术为了强化透明质酸的合成，以及获得高产的新菌株，提出一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。具体技术方案如下：一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。进一步地，上述的基因工程菌还转入了UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上。进一步地，上述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。一种高产透明质酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)构建乳酸脱氢酶基因的同源重组交换质粒；(2)将同源重组交换质粒转入谷氨酸棒杆菌，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌；(3)将透明质酸合成酶基因转入上述乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌，得到基因工程菌。进一步地，上述构建方法还包括：将UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上转入步骤(3)所述基因工程菌。进一步地，上述构建方法还包括：优选将UDP-葡萄糖脱氢酶基因转入步骤(3)所述基因工程菌。进一步地，所述构建同源重组交换质粒的方法包括：(1)以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物dLDH-F和dLDH-R进行PCR，得到乳酸脱氢酶基因中间片段；(2)以质粒pK18mobmobsacB为模板，利用引物pK18-F和pK18-R进行PCR，获得含有大肠杆菌复制起始位点ori序列和卡那霉素抗性基因序列的片段；(3)连接步骤(1)和步骤(2)中的片段，获得重组质粒pK18dLDH；其中，所述引物序列如下：dLDH-F：5’-TTTAGGCCCGGCAGATCACCTTGCGATCATC-3’dLDH-R：5’-TCTGACGCTCTTCTAGTTCGACAACGCGGC-3’pK18-F：5’-CGAACTAGAAGAGCGTCAGACCCCGTAGAA-3’pK18-R：5’-GGTGATCTGCCGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTA-3’。将上述重组质粒pK18dLDH转入到谷氨酸棒杆菌中，筛选阳性克隆，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌。进一步地，所述构建同源重组交换质粒的方法包括：(1)以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物dLDH-1和dLDH-2进行PCR，获得乳酸脱氢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还转入了UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。4.一种高产透明质酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建乳酸脱氢酶基因的同源重组交换质粒；(2)将同源重组交换质粒转入谷氨酸棒杆菌，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌；(3)将透明质酸合成酶基因转入上述乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌，得到基因工程菌。5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，还包括：将UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上转入步骤(3)所述基因工程菌。6.权利要求1-3任一项所述高产透明质酸的基因工程菌在制备透明质酸中的应用。7.一种利用基因工程菌生产透明质酸的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，成方宇，沈忠耀，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11