一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)对无菌细胞冻存管采用梯度降温冷冻法进行冻存。采用本发明专利技术冻存方法对脐血造血干细胞进行冻存，大大减少了冻存液对脐血造血干细胞的损伤作用，有利于脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高，能够更好的保持脐血造血干细胞的生物学特征。

A gradient cryopreservation method for umbilical cord blood hematopoietic stem cells

The present invention discloses a kind of umbilical cord blood hematopoietic stem cells gradient cooling and cryopreservation method, which comprises the following steps: (1) from umbilical cord blood hematopoietic stem cells, after centrifugation, the supernatant drained; (2) the step (1) obtained liquid in freezing liquid, army uniform, formation of cell suspension and deposit in the freezing tube into a sterile cell; (3) depository by gradient cooling freezing freezing freezing of sterile cells. The invention adopts the method of cryopreservation of umbilical cord blood hematopoietic stem cells were frozen, greatly reducing the damage of frozen liquid stem cells on umbilical cord blood, umbilical cord blood hematopoietic stem cells in favor of cryopreservation and resuscitation cell viability in the process of improving, to better maintain the biological characteristics of human umbilical cord blood hematopoietic stem cells.

【技术实现步骤摘要】
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种脐血造血干细胞的冻存方法。
技术介绍
脐血也叫脐带血，是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。脐血中含有大量的干细胞，干细胞是生命的种子，它会分化成人体的各种细胞，结出各种不同的果实——血液细胞，神经细胞，骨骼细胞等等。随着科技的发达，医学专家研究出利用脐带血中的干细胞来治疗疾病的方法。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体。这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。近三十年来的医学研究发现，脐血中含有非常丰富的造血干细胞(HSC)，可以重建人体造血和免疫系统，可用于造血干细胞移植，治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性及先天性疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，已经被广泛地应用于临床，是宝贵的人类生物资源。世界范围内，目前脐血已经用于治疗各种类型白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、粘多糖病、地中海贫血、骨髓发育不良症候群、原发性免疫缺陷病、慢性肉芽肿等80多种疾病。我国卫生部颁发的《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)》中规定，脐带血造血干细胞治疗技术适应症包括以下10余类：骨髓衰竭、血红蛋白病、重症免疫缺陷病、代谢性疾病、白血病、骨髓增生异常综合症、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性肿瘤、重症再生障碍性贫血和重症放射病等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，以提供脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)对无菌细胞冻存管采用梯度降温冷冻法进行冻存。所述步骤(3)具体为：将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。所述步骤(2)的细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/mL。所述步骤(2)中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基组成；所述培养基由以下组分组成：基础培养基、人血清白蛋白、杨梅素、三七总皂苷、大黄素、亚油酸、胰蛋白酶、抑肽酶、光蛋白聚糖、碱性成纤维细胞生长因子、丙酮酸、L-谷氨酰胺、叶酸、β-巯基乙醇、黄芪多糖、转铁蛋白、维生素、氨基酸。优选的，所述培养基中，各组分的含量如下：基础培养基10-50g/L，人血清白蛋白5-20g/L，杨梅素5-20mg/L，三七总皂苷5-20mg/L，大黄素5-20mg/L，亚油酸2-10mg/L，胰蛋白酶1-10mg/L，抑肽酶4-10mg/L，光蛋白聚糖5-20μg/L，碱性成纤维细胞生长因子1-10μg/L，丙酮酸5-15mg/L，L-谷氨酰胺5-20mg/L，叶酸1-15mg/L，β-巯基乙醇2-10mg/L，黄芪多糖50-80mg/L，转铁蛋白1-10mg/L，维生素80-500mg/L，氨基酸80-500mg/L。所述人血清白蛋白为人脐血人血清白蛋白；基础培养基为IMDM培养基；所述维生素为水溶性维生素；所述氨基酸为多种氨基酸复合物。所述冻存保护剂为渗透性冷冻保护剂，由甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇的一种或多种组成。所述冻存保护剂、胎牛血清、培养基的体积比为1：1～3：2～4。有益效果：采用本专利技术冻存方法对脐血造血干细胞进行冻存，大大减少了冻存液对脐血造血干细胞的损伤作用，有利于脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高，能够更好的保持脐血造血干细胞的生物学特征。具体实施方式根据下述实施例，可以更好的理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/mL。细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％CO2培养箱中培养。其中，培养基可采用本专利技术的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：1：4组成；其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基24g/L，人血清白蛋白12g/L，杨梅素12mg/L，三七总皂苷12mg/L，大黄素13mg/L，亚油酸6mg/L，胰蛋白酶5mg/L，抑肽酶8mg/L，光蛋白聚糖13μg/L，碱性成纤维细胞生长因子5μg/L，丙酮酸11mg/L，L-谷氨酰胺12mg/L，叶酸8mg/L，β-巯基乙醇6mg/L，黄芪多糖68mg/L，转铁蛋白5mg/L，维生素280mg/L，氨基酸260mg/L。冻存保护剂为二甲基亚砜。实施例2一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/mL。细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％CO2培养箱中培养。其中，培养基可采用本专利技术的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：2：2组成；其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基10g/L，人血清白蛋白15g/L，杨梅素10mg/L，三七总皂苷15mg/L，大黄素10mg/L，亚油酸2mg/L，胰蛋白酶10mg/L，抑肽酶10mg/L，光蛋白聚糖10μg/L，碱性成纤维细胞生长因子1μg/L，丙酮酸5mg/L，L-谷氨酰胺15mg/L，叶酸15mg/L，β-巯基乙醇10mg/L，黄芪多糖80mg/L，转铁蛋白1mg/L，维生素360mg/L，氨基酸180mg/L。冻存保护剂为二甲基亚砜、甘油、乙酰胺的混合物。实施例3一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)对无菌细胞冻存管采用梯度降温冷冻法进行冻存。

【技术特征摘要】
1.一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取脐血造血干细胞，经过离心后，倒掉上层清液；(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；(3)对无菌细胞冻存管采用梯度降温冷冻法进行冻存。2.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。3.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：所述步骤(2)的细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/mL。4.根据权利要求1所述的脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：所述步骤(2)中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基组成；所述培养基由以下组分组成：基础培养基、人血清白蛋白、杨梅素、三七总皂苷、大黄素、亚油酸、胰蛋白酶、抑肽酶、光蛋白聚糖、碱性成纤维细胞生长因子、丙酮酸、L-谷氨酰胺、叶酸、β-巯基乙醇、黄芪多糖、转铁蛋白、维生素、氨基酸。5.根据权利要求4所述的脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，其特征在于：所述步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱学义，徐峰波，聂江华，张雪梅，陈乐，李欢欢，
申请(专利权)人：河南省银丰生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41