一种常见致病细菌感染检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种常见致病细菌感染检测试剂盒，包括用以进行PCR扩增的四组检测引物、双蒸水、2x PCR master mix、阳性对照基因组DNA。本发明专利技术能快速诊断细菌性感染的常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。

A common detection kit for pathogenic bacteria infection

The invention discloses a common pathogenic bacterial infection detection kit, including for PCR amplification of four groups were detected, double distilled water, 2x PCR master mix, positive control of genomic DNA. The invention can quickly diagnose pathogenic bacteria of bacterial infection, provides the possibility for the rapid diagnosis of patients with this pathogen, helps to reduce the infection rate of death and disability.

【技术实现步骤摘要】
一种常见致病细菌感染检测试剂盒
本专利技术属于致病微生物检测
，具体涉及一种常见致病细菌感染检测试剂盒。
技术介绍
目前，细菌感染依然在住院和门诊病人中占有较大的比例。虽然几十年以来抗生素研究的进展较为迅速，但是由于不能精确地诊断出致病微生物的属种，导致抗生素运用盲目，细菌性感染导致的死亡率和致残率未有明显地改善，尤其针对手术后感染、免疫功能低下、高龄、新生儿病人的细菌性感染，转变为休克、急性或慢性器官衰竭、甚至死亡的比例依然较高。因此，准确、快速诊断致病细菌而正确指导抗生素应用，对细菌性感染的治疗仍然是非常迫切的。现阶段，临床实验室主要依据细菌的生化特点进行微生物诊断，缺点包括：(1)需要自各种临床体液、组织中分离培养细菌，而较高比例的微生物因无法培养出而导致漏诊；(2)由于这些生化诊断方法的代谢数据库无法包括所有潜在感染的细菌数据而导致漏诊某些细菌；(3)诊断依赖于细菌代谢特点，而基因表达代谢受环境影响较大导致误诊；(4)因为细菌种属间生化特征相似而导致无法精确诊断细菌至种；(5)生化诊断需要1-3日或更长时间，导致延误抗生素治疗。因此需要研发出更快、更精确的细菌诊断方法。16SrRNA是细菌高度保守的序列，是细菌化石，可以用于细菌属种的鉴定，尤其是对于实验室无法分离培养的微生物，运用聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)能直接扩增菌落PCR而进行测序诊断。其非常明显的缺点是，菌种间存在很高比例的16rRNA序列相似，导致很高比例的细菌无法鉴定到种或结果不确定。当然，此方法还是比生化鉴定方法较为精确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种常见致病细菌感染检测试剂盒。本专利技术的具体技术方案如下：一种常见致病细菌感染检测试剂盒，包括用以进行PCR扩增的四组检测引物、双蒸水、2xPCRmastermix、阳性对照基因组DNA，其中，四组检测引物分别为第一检测引物组、第二检测引物组、第三检测引物组和第四检测引物组，每组引物均包括一正向引物和一反向引物，各引物的浓度为100μM，第一检测引物由V6-891F和V6-1033R组成，分别如SEQIDNO01和SEQIDNO02所示；第二检测引物由V3-334F和V3-537R组成，分别如SEQIDNO03和SEQIDNO04所示；第三检测引物由V6-961F和V6-1085R组成，分别如SEQIDNO05和SEQIDNO06所示；第四检测引物由V3-334F和V6-1085R组成，分别如SEQIDNO03和SEQIDNO06所示；2xPCRmastermix的配方为：Taq0.1U/μL，dNTP各0.4mM，100mMKCl，3mMMgCl2，20mMTris-HCl，pH8.3；阳性对照基因组DNA的浓度为1ng/μL。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系的体积为50μL，具体如下：进一步优选的，所述PCR扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。本专利技术的有益效果是：本专利技术能快速诊断细菌性感染的常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。附图说明图1为本专利技术实施例3中PCR产物1(142bp)、2(203bp)、3(124bp)电泳图。退火温度50.5℃。图2为本专利技术实施例3中PCR产物4(751bp)电泳图。选择退火温度45℃完成了所有测试。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1细菌基因组DNA的提取参照QIAampDNABloodMiniKit(51304,QIAGEN,Germany)，按照对于革兰氏阳性菌和难裂解细菌的步骤进行。(1)在将病人体液离心7500rpm，10min离心得到细菌沉渣。(2)利用180μL溶液(20mg/mL溶菌酶(L1667-1G,Sigma,USA)，20mMTris·HCl,pH8.0，2mMEDTA，1.2％Triton)悬浮细菌沉渣。在37℃培养至少30min。(3)加20μL蛋白酶K，加200μLBufferAL混匀，旋涡振荡,56℃水浴锅中孵育，30min，然后95℃15min。(4)离心几秒，加入200μL乙醇(96-100％)至样品，振荡15s混匀后转移至1.5mL离心管，去掉盖子内部液体。注意样品、BufferAL的加样顺序，乙醇要充分混匀。加乙醇后可能会有白色沉淀，要将沉淀全部加入柱内。(5)将混合液以及沉淀小心转移到QIAampMini离心柱内(柱子放置于2mL收集管内)，不要弄湿管壁和膜外缘，关闭盖子离心8000rpm，1min，转移离心柱至2mL离心管，丢弃含有滤液的管。(6)小心打开离心柱，加入500μLBufferAW1，不要弄湿管壁，关闭盖子，8000rpm，离心1min，将柱子换到干净的2mL收集管，弃掉收集管和废液。(7)小心打开离心柱，加入500μLBufferAW2，不要弄湿管壁。关闭盖子，14000rpm，离心3min，将离心柱转移到新的2mL收集管，弃掉原来的管和废液，全速离心1min，有助于消除BufferAW2滞留的机会。(8)将离心管移至干净的1.5mL微量离心管，弃掉管和废液。小心打开离心柱，加入200μLBufferAE或蒸馏水，室温下放置1-5min，8000rpm下离心1min。(9)收集洗脱液，加200μLBufferAE第2次洗脱会提高产率15％。DNA置于-20℃储存。实施例2常见致病菌的引物首先总结了医院内各种细菌性感染的常见致病菌，并针对16SrRNA报收系列设计引物，见表1：表1.常见致病菌的引物实施例3各PCR反应条件测试(1)PCR扩增反应体系，见表2：表2.PCR扩增反应体系(2)PCR扩增反应程序，见表3：表3.PCR扩增程序(3)电泳验证，见图1、2。(4)PCR产物纯化将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，利用磁珠法(GEL_100长春市志昂生物科技有限公司)进行纯化，步骤如下：①切好的胶块样品(胶块不宜大于0.3g)直接转入96孔板，每孔加入500μL吸附液U，用硅胶密封垫封住96孔板后55℃温浴15min，期间旋涡振荡混匀3次，使胶块彻底融化。②将96孔板瞬时离心，揭开硅胶密封垫，每孔加入混匀的磁珠10μL，用硅胶密封垫封住96孔板，旋涡振荡混匀，室温吸附10min，期间振荡混匀2～3次。③吸附结束后旋涡振荡混匀，将96孔板瞬时离心，然后置于磁力架上磁吸5min。揭开硅胶密封垫，连同磁力架一起将96孔板倒置，倒出所有液体，注意动作轻柔不要倒出磁珠，保持96孔板倒置的状态置于吸水纸上，将吸水纸、96孔板连同磁力架一起倒置放入平板离心机，开始离心，离心机加速到600rpm后立即停止离心，取出96孔板。④连同磁力架一起将96孔板翻转至开口向上，并将96孔板从磁力架上取下。每孔样品中加入200μL洗涤液，用硅胶密封垫封住96孔板，充分旋涡振荡混匀，将96孔板瞬时离心，放回磁力架磁吸2min，揭开硅胶密封垫，连同磁力架一起将96孔板倒置，倒出所有液体，注意动作轻柔不要倒出磁珠，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种常见致病细菌感染检测试剂盒，其特征在于：包括用以进行PCR扩增的四组检测引物、双蒸水、2x PCR master mix、阳性对照基因组DNA，其中，四组检测引物分别为第一检测引物组、第二检测引物组、第三检测引物组和第四检测引物组，每组引物均包括一正向引物和一反向引物，各引物的浓度为100μM，第一检测引物由V6‑891F和V6‑1033R组成，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示；第二检测引物由V3‑334F和V3‑537R组成，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 04所示；第三检测引物由V6‑961F和V6‑1085R组成，分别如SEQ ID NO 05和SEQ ID NO 06所示；第四检测引物由V3‑334F和V6‑1085R组成，分别如SEQ ID NO 03和SEQ ID NO 06所示；2x PCR master mix的配方为：Taq 0.1U/μL，dNTP各0.4mM，100mM KCl，3mM MgCl2，20mM Tris‑HCl，pH8.3；阳性对照基因组DNA的浓度为1ng/μL。

【技术特征摘要】
1.一种常见致病细菌感染检测试剂盒，其特征在于：包括用以进行PCR扩增的四组检测引物、双蒸水、2xPCRmastermix、阳性对照基因组DNA，其中，四组检测引物分别为第一检测引物组、第二检测引物组、第三检测引物组和第四检测引物组，每组引物均包括一正向引物和一反向引物，各引物的浓度为100μM，第一检测引物由V6-891F和V6-1033R组成，分别如SEQIDNO01和SEQIDNO02所示；第二检测引物由V3-334F和V3-537R组成，分别如SEQIDNO03和SEQIDNO04所示；第三检测引物由V6-961F和V6-1085R组成，分别如SEQIDNO05和SEQIDNO06所示；第四检...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明席，姜涛，胡韶华，周亚军，边彩，
申请(专利权)人：华侨大学，福州迪恩应用生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35