水稻深绿穗基因的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻深绿穗基因的用途：提高稻穗中光合色素的含量；调控该水稻深绿穗的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；光合色素包括叶绿素、类胡萝卜素。该水稻深绿穗基因还能提高稻穗的净光合速率。

The application of green rice spike gene

The invention discloses an application of green rice spike gene: increase the photosynthetic pigment contents in rice; nucleotide sequence regulation of the rice green spike gene is shown as SEQ ID NO:1; photosynthetic pigment including chlorophyll, carotenoid. The green rice panicle gene can increase the net photosynthetic rate of rice light.

【技术实现步骤摘要】
水稻深绿穗基因的应用
本专利技术涉及一个水稻穗色相关基因及其功能，属于植物分子遗传领域。
技术介绍
光合作用是利用叶绿体中的叶绿素(Chlorophyll)，在可见光照射下，将二氧化碳和水转化为有机物。叶绿素含量在一定范围内与光合速率成正相关。穗的光合作用对籽粒的生物量累积具有一定的作用，如麦穗光合作用对籽粒的贡献可达10％～76％，而稻穗光合能力较弱，对籽粒的贡献只有4％～23％，可见稻穗的光合能力还有很大的提升空间。因此，利用新优异基因，提高稻穗中叶绿素的含量，增加穗光合作用对籽粒的贡献率，将可能更有效促地促进水稻高产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种水稻深绿穗基因的用途。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种水稻深绿穗基因的用途，用于提高稻穗中光合色素(包括叶绿素、类胡萝卜素)的含量；调控该水稻深绿穗的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。作为本专利技术的水稻深绿穗基因的用途的改进，用于提高稻穗中光合作用的光能转化效率。本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术利用人工辐射诱变粳稻品种中花11，在突变体库中获得了一个罕见的深绿穗突变体，迄今在水稻中还未曾报道。与中花11的黄绿穗色相比，该突变体的穗色深绿(图1)，穗的叶绿素与类胡萝卜素的含量显著性增加(图2)，穗中光合作用的光系统II原初光能转换效率也显著性提高(图3)，对水稻穗的光合机理研究及其育种应用具有重要意义。将水稻深绿穗突变体与野生型品种巴香占杂交，F1表型为野生型。在F1自交的F2代群体中，野生型与突变型的比例经χ2检验符合3:1，表明深绿穗突变表型受一个隐性基因控制。利用图位克隆技术，将目的基因定位水稻第1号染色体上物理距离为91kb的两个分子标记之间。根据水稻基因组数据库的注释，将其中1个预测基因(登录号：LOC_Os01g62060)确定为候选基因，通过RT-PCR分析表明该基因在野生型中表达，在深绿穗突变体中不表达(图4)。为了验证该基因的功能，构建LOC_Os01g62060基因的表达载体，遗传转化到水稻深绿穗突变体中，获得相应的转基因水稻植株，该转基因植株的穗色恢复为野生型的黄绿色(图5)，证明该基因调控穗色深绿的功能，克隆了该基因。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白功能未知，与已知的叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用等途径的相关基因没有任何同源性，是一个没有报道过的新功能基因，具有重要的研究意义和潜在的应用价值。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为水稻深绿穗突变体与对照中花11的穗色；图2为水稻深绿穗突变体与对照中花11穗的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量，**表示t检验存在极显著性(P<0.01)差异，下同；图3为水稻深绿穗突变体与对照中花11穗的净光合速率；图4为基因LOC_Os01g62060的RT-PCR表达分析，以持家基因Actin做为内参；图5为基因LOC_Os01g62060遗传转化水稻深绿穗突变体后的植株穗色。具体实施方式实施例1、水稻深绿穗突变体的获得与种植采用60Co的γ射线辐射，以300Gy的照射剂量处理水稻粳稻品种中花11的种子500g。5月初，将辐射后的种子(M1)播种在水稻田的苗床上，6月初进行移栽，成熟后单株收获种子(M2)。第2年，在水稻田中每个M2株系分别种植30株，鉴定表型。其中，在一个M2株系中发现深绿穗突变表型的植株。收获突变株的种子，连续种植2代，即M3与M4代都出现相同的深绿穗突变表型，表明该突变表型是可稳定遗传的。深绿穗突变体M4代收获的种子(M5)代用于以下的实验研究。实施例2、水稻穗的叶绿素、类胡萝卜素含量测定在水稻抽穗期，选取长势一致的9株深绿穗突变体与9株对照中花11，对其新抽的穗，参照Lichtenthaler等方法(引自：MethodEnzymol,1987,148:350-382)测定叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量；每3株的叶片混合成1个样品，共3个生物性重复样品。测定时，每份样品重复测定3次，取平均值，对3份样品的平均值进行统计分析，采用T-Test检验突变体与野生型之间的显著性差异。所得结果为深绿穗突变体穗的叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素含量都显著性高于野生型对照中花11。实施例3、水稻穗的净光合速率测定在水稻抽穗期，选取长势一致的9株深绿穗突变体与9株对照中花11，对其新抽的穗，按照向珣朝等方法(引自：中国农学通报,2005,21(1):81-84)，测定仪分穗中光合作用的光系统II原初光能转换效率，取样方式和统计分析同实施例2。所得结果为深绿穗突变体穗中光合作用的光系统II原初光能转换效率显著性高于野生型对照中花11。实施例4、水稻深绿穗基因的精细定位用深绿穗突变体与野生型品种巴香占进行杂交，其F1代植株均表现为野生型。F1代自交得到F2群体，F2代中出现野生型与突变型两种表型，其比例经χ2检验符合3:1，表明水稻深绿穗突变体是由单个隐性基因控制。采用图位克隆技术，通过分析F2群体中的深绿穗突变株的染色体交换率，对目的基因进行定位。首先，分别提取F2群体中深绿穗突变型个体的基因组DNA。提取方法：取水稻叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(0.1mol/LTris-ClpH8.0，500mmol/LNaCl，1.25g/LSDS)，65℃温育30min。加200μl5mol/LKAC，混匀后，冰浴30min。再加500μl氯仿，混匀，10000r/min离心5min，取上清，加2/3上清体积的异丙醇，混匀，12000r/min离心5min。弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，倒置晾干，加100μlTE溶解DNA。接着，用已公布的覆盖水稻12条染色的SSR分子标记(引自：Nature，2005,436(11):793-800)对F2群体中20个突变株的DNA分别进行PCR扩增。PCR试剂采用南京博尔迪生物技术有限公司的2×PCRMix，20μl反应体系，方法见产品说明。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸5分钟。然后，用1×TAE电泳液制备浓度为3％的琼脂糖凝胶，将20μlPCR产物与2μl10×LoadingBuffer混合，加到凝胶的点样孔中，在100V恒压下电泳30min。用溴化乙锭对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)。在紫外透射仪上，用305nm波段观察凝胶上的电泳条带。通过分析每个标记的电泳带型，计算分子标记与目的基因的遗传距离，将目的基因初步定位在了水稻1号染色体的长臂上RM8084和RM11860两个标记之间。最后，根据水稻基因组的序列(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，在标记RM8084与RM11860之间的DNA序列上，设计了分子标记ID21、ID26与CAPS1的PCR引物，ID21：5’-GTGGATGTGGAATGGAGGAAGT-3’与5’-AGGCAGCAGCTGGAGAAGAAT-3’，ID26：5’-GATAATGCCACATGATTCTGA-3’与5’-TAACACGATTGGTGCCTACAT-3’，CA本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻深绿穗基因的用途，其特征是：提高稻穗中光合色素的含量；调控该水稻深绿穗的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.水稻深绿穗基因的用途，其特征是：提高稻穗中光合色素的含量；调控该水稻深绿穗的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的水...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈析丰，刘亚萍，沈佳弘，马伯军，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33