一种抑制感光细胞凋亡上的方法及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用技术

本发明专利技术涉及一种抑制感光细胞凋亡上的方法及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用，我们利用小鼠光损伤模型及基因表达谱芯片分析，发现光损伤诱导了SCF在感光细胞中表达明显上调，并促进了其受体KIT的磷酸化水平明显升高，提示SCF/KIT信号通路在光诱导视网膜损伤过程中被激活，发现干细胞因子/酪氨酸激酶受体（SCF/KIT）信号通路能够抑制感光细胞的凋亡，最终对视网膜产生神经保护作用。因此，SCF/KIT信号通路能够抑制感光细胞凋亡可用于视网膜变性相关疾病的预防和治疗。

A method of inhibiting photoreceptor cell apoptosis and the application of SCF over expressed virus in the preparation of drugs for inhibiting photoreceptor cell apoptosis

The invention relates to a method for inhibiting photoreceptor cell apoptosis and the expression of SCF virus use in preparing medicine for inhibiting apoptosis of the photoreceptor, we use the mouse model of light damage and gene expression microarray analysis, found that the light induced expression of SCF is upregulated in photoreceptor cells, and promote the phosphorylation of KIT receptor the level was significantly increased, suggesting that SCF/KIT signaling pathway is activated in light induced retinal damage in the process, found that stem cell factor / receptor tyrosine kinase (SCF/KIT) signaling pathway can inhibit the apoptosis of photoreceptor cells in the retina, and ultimately produce neuroprotective effects. Therefore, SCF/KIT signaling pathway can inhibit photoreceptor cell apoptosis and can be used for the prevention and treatment of retinal degeneration related diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制感光细胞凋亡上的方法及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用
本专利技术具体涉及一种抑制感光细胞凋亡上的方法及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用。
技术介绍
视网膜变性是一类因视网膜神经细胞逐渐发生进行性变性而导致视力丧失的异质性疾病，其致病因素比较复杂，主要包括遗传因素和环境因素。流行病学调查显示，视网膜变性是目前我国导致视力丧失的首要因素，而视网膜感光细胞凋亡是引起我国眼盲和低视力的主要原因之一。由于目前感光细胞凋亡的分子机制尚不明了，至今对视网膜变性相关疾病尚无有效的预防和治疗手段。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的提供了一种抑制感光细胞凋亡上的方法及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用。一种抑制感光细胞凋亡上的方法，通过激活SCF/KIT信号通路抑制感光细胞凋亡。所述的方法包括：通过SCF在感光细胞中表达增加促进了SCF/KIT信号通路被激活。SCF为干细胞因子，亦为KIT的配体（KITL）。KIT为酪氨酸激酶受体KIT，亦为c-Kit。SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用。所述的SCF过表达病毒为腺相关病毒AAV8-Scf。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了SCF/KIT信号通路在抑制感光细胞凋亡上的应用及SCF过表达病毒在制备抑制感光细胞凋亡药物上的应用，利用基因敲除以及腺相关病毒过表达技术，发现干细胞因子/酪氨酸激酶受体KIT（SCF/KIT）信号通路能够抑制感光细胞的凋亡，最终对视网膜产生神经保护作用。因此，SCF/KIT信号通路能够抑制感光细胞凋亡可用于视网膜变性相关疾病的预防和治疗。附图说明图1为强光诱导了两月龄的C57BL/6J小鼠视网膜轻微的损伤分析结果图。（其中图1中A图为抗GFAP的视网膜切片免疫荧光结果；B图为视网膜石蜡切片H&E染色结果；C图为视网膜外核层厚度的定量分析统计图。）图2为光损伤诱导了视网膜的基因表达改变分析结果图。（其中A图为用于基因芯片分析的光诱导视网膜损伤模型；B图为正常光照条件下（Control）和强光处理（LD）的视网膜的基因芯片表达谱分析的热图；C图为对基因芯片结果验证的RT-PCR结果。）图3为光损伤诱导KITL的表达及激活受体KIT分析结果图。（其中A、C、D图分别为检测KITL、KIT以及p-KIT蛋白量的WesternBlot实验结果；B图对KITL的含量的数据统计分析。E图为对KIT以及p-KIT的蛋白含量的数据统计分析。）图4为光诱导KITL在感光细胞的内节表达分析结果图。（其中A、B图分别为正常光照条件下和强光处理的视网膜抗SCF的切片免疫荧光结果。a、b图分别来自A图和B图白色方框区域的放大。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；IS，感光细胞内节；OS，感光细胞外节。）图5为Wps突变阻断视网膜中的KIT活性分析结果图。（其中A为检测眼内注射KITL之后的KIT、ERK和AKT的磷酸化水平变化的WesternBlot结果图（左）以及数据统计图（右）。B为抗ACK45和AB5506的两月龄WT和Wps纯合子小鼠视网膜切片免疫荧光图。左侧为两抗体识别受体KIT部位示意图；白色箭头为KIT阳性信号。RGC，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；ONL，外核层；IS，感光细胞内节。标尺为50μm。）图6为Wps突变促进光诱导的视网膜损伤分析结果图。（其中A为光损伤模式图；B为ERG分析的振幅波形图。上半部的振幅图为暗适应标准ERG检测结果图，下半部的振幅图为明适应的视锥反应ERG检测结果图；C和D分别为暗适应标准ERG和明适应的视锥反应的ERG数据统计结果图。E为抗GFAP的视网膜切片免疫荧光图。Control组为正常光照处理，LD组为强光照处理；RGC，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层。标尺为50μm；**代表p<0.01。）图7为Wps突变促进光诱导的视网膜退行性变性分析结果图。（其中A为H&E染色的视网膜组织形态分析结果图。上部为H&E染色的视网膜切片图，下部为视网膜外核层厚度分析的数据统计图。B为检测Rhodopsin在视网膜中表达情况的结果图。上部为抗Rhodopsin的视网膜切片免疫荧光结果图，下部为WesternBlot检测Rhodopsin在视网膜中的表达情况的条带图（左）和数据统计结果图（右）。C和D分别为抗Opsin的视网膜切片免疫荧光结果图以及其Opsin阳性细胞数量的统计结果图。E为TUNEL分析视网膜细胞凋亡情况的结果图。左边为TUNEL的切面荧光染色结果图，右边为TUNEL阳性细胞数量的统计结果图。Control组为正常光照处理，LD组为强光照处理；ONL，外核层；IS，感光细胞内节；OS，感光细胞外节。标尺为50μm；*代表p<0.05；**代表p<0.01。）图8为验证AAV-CMV-GFP病毒能特异性感染视网膜感光细胞。（其中A为AAV-CMV-GFP病毒载体信息图；B为向Wps纯合子小鼠注射AAV-CMV-GFP病毒后的眼底图。左列为明场眼底图，右列为GFP绿色荧光眼底图。C为感染AAV-CMV-GFP病毒后的视网膜切片荧光图。ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮。标尺为50μm，白色箭头为GFP阳性信号。）图9为AAV-CMV-Scf病毒在视网膜中的过表达SCF情况分析结果图。（其中A为AAV-CMV-Scf病毒载体信息图。B为感染AAV-CMV-Scf病毒后的视网膜切片抗SCF的免疫荧光图。）图10为AAV-CMV-Scf病毒过表达的SCF对光诱导的视网膜变性的作用分析结果图。（其中A为分析光诱导视网膜损伤后的视网膜结构变化的H&E染色结果图。B为分析光诱导损伤后的抗视蛋白Rhodopsin的免疫荧光图（上排）和细胞凋亡分析的TUNEL检测（下排）。NL组为正常光照处理，LD组为强光照处理；RGC，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；IS，感光细胞内节；OS，感光细胞外节。）具体实施方式第一部分的实施方式：实验动物为2月龄C57BL/6J黑色小鼠。采用正常光（200lux）和强光(15,000lux，飞利浦冷光源LED灯)从上往下持续性照射的饲养笼中饲养6天或18天，随后通过H&E染色视网膜组织形态学分析以及抗GFAP免疫荧光的Muller胶质细胞重新激活分析，建立合适的光诱导视网膜损伤模型。随后，利用基因表达谱芯片分析光损伤诱导的基因表达的改变情况，筛选感兴趣的候选靶基因。最后，通过RT-PCR、Westernblot以及免疫荧光等实验，验证由光损伤诱导的候选靶基因表达的变化情况。本研究采用野生型C57BL/6J小鼠结合长时间的强光照处理，建立了较轻微的光损伤模型，为后续分析光诱导基因表达提供更长的时间窗；随后，利用基因芯片分析光损伤诱导的视网膜基因表达的变化情况，最后运用RT-PCR实验进一步验证差异基因的表达，筛选出一系列的候选神经保护相关分子，其中包括SCF/KIT信号通路；最后，通过WB以及IF检测发现KITL和KIT均表达在成熟的视网膜中，且光损伤诱导了KITL的表达并促进KIT的磷酸化水平上升。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制感光细胞凋亡上的方法，其特征在于，通过激活SCF/KIT信号通路抑制感光细胞凋亡。

【技术特征摘要】
1.一种抑制感光细胞凋亡上的方法，其特征在于，通过激活SCF/KIT信号通路抑制感光细胞凋亡。2.根据权利要求1所述的一种抑制感光细胞凋亡上的方法，其特征在于，所述的方法包括：通过SCF在感光细胞中表达增加促进了SCF...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯陵，李辉荣，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33