一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白由犬白细胞介素2与犬干扰素α经柔性linker连接而形成，融合蛋白与冻干保护剂混配后胡静冷冻干燥即可得到重组犬长效干扰素。所述重组犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高10倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。

Recombinant canine long-acting interferon and its fusion protein for preparing this long-acting interferon and its preparation method

The invention discloses a fusion protein and preparation method of recombinant canine interferon and preparing the long-acting interferon, the fusion protein by canine interleukin 2 and canine interferon alpha connection formed by flexible linker fusion protein and cryoprotector mixed with Hu Jing after freeze-drying to obtain recombinant canine interferon. The recombinant canine long-acting interferon can significantly improve the half-life of interferon in dogs, and increase the half-life of interferon by more than 10 times compared with that of normal dogs. It also has broad spectrum antiviral effect and can improve the immune response of dogs.

【技术实现步骤摘要】
一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
根据中国宠物行业现状分析，截止到2014年末我国宠物行业的市场规模已经达到1058亿人民币，而中国宠物医疗行业目前仅占约20％，相比较宠物行业相对成熟的美国市场，其宠物医疗的产值比达到50％，中国宠物医疗行业存在巨大的发展空间。犬是人类忠诚的朋友，随着国内宠物犬等犬类饲养数量的大幅度增加，犬类疾病发病率、死亡率的不断升高，给人类造成精神和经济上的双重损失。犬与人类亲密接触导致人类被犬病毒感染的几率极高，如狂犬病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒等，都会给人类健康带来极大的威胁。据相关科学研究报道干扰素作为一类重要的细胞因子，在对犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎和犬冠状病毒病等疾病的治疗中均具有一定的疗效。因此积极研究干扰素在犬病毒性疾病治疗中的作用具有广阔的应用前景。IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。IL-2即白细胞介素-2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在医学领域上商品化的重组人IL-2已经用于肿瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的治疗。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于在家禽临床上应用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组犬长效干扰素及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法，所述重组犬长效干扰素可显著提高犬干扰素的半衰期，较普通犬干扰素的半衰期提高10倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高犬自身的免疫应答。本专利技术采取的技术方案为：一种由犬白细胞介素2与犬干扰素α组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示。本专利技术还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组2。所述基因组1和所述基因组2均可编码所述融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现犬IL-2和IFN-α原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.19、0.27，GC百分比为39.6％、59.7％；而通过对犬IL-2和IFN-α基因优化后得到重组基因基因组2在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为1.0、1.0，GC百分比48.8％、55.6％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。本专利技术还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNα。含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。本专利技术还提供了一种重组犬长效干扰素，所述重组犬长效干扰素由所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/LPBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。本专利技术还公开了所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNα，其制备方法为：(1)设计引物，通过反转录得到或者人工合成连接有柔性linker序列的犬白细胞介素2和犬干扰素α的目的基因；通过柔性linker将犬白细胞介素2和犬干扰素α的目的基因连接起来，目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示；(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rIL2-IFNα。所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。所述基因组1的获取方法为：a.引物设计犬白细胞介素2(IL-2)的引物序列为：上游IL-2-F1：CGGGATCCATGTACAAAATGCAACTC，带有BamHI酶切位点；下游IL-2-R1：ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGTCAGTGTTGAGAAG，带有柔性linker；犬干扰素α(IFN-α)的引物序列为：上游IFN-α-F1：GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGCCCTGCCC，带有柔性linker；下游IFN-α-R1：CCCTCGAGTTTCCTCCTCCTTACT，带有XhoI酶切位点；b.从犬肝脏中提取RNA，通过反转录获得IL-2和IFN-α的目的基因，两者的基因序列分别如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由犬白细胞介素2与犬干扰素α组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

【技术特征摘要】
1.一种由犬白细胞介素2与犬干扰素α组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCELISTING400〈1〉所示。2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCELISTING400〈3〉所示，记为基因组2。3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。5.一种重组犬长效干扰素，其特征在于，所述重组犬长效干扰素由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。6.根据权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求3所述的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNα，其制备方法为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，韩国祥，赵雨，夏兵兵，徐慕珍，程正阳，徐文俊，单雪芹，
申请(专利权)人：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34