脂蛋白复合物及其制备和用途制造技术

本公开涉及脂蛋白复合物和脂蛋白群体以及它们在治疗和/或者预防血脂异常疾病、障碍和/或者病症中的用途。本公开还涉及使用基于热循环的方法进行载脂蛋白的重组表达、载脂蛋白的纯化以及脂蛋白复合物的产生。

Lipoprotein complex and its preparation and use

The present disclosure relates to lipoprotein complexes and lipoprotein groups and their use in the treatment and / or prevention of dyslipidemia, disorders, and / or disorders. The present disclosure also relates to the use of thermal cycling based methods for the recombinant expression of apolipoproteins, the purification of apolipoproteins, and the generation of lipoprotein complexes.

【技术实现步骤摘要】
脂蛋白复合物及其制备和用途本专利技术是基于申请日为2012年2月6日，申请号为“201280015257.3”(国际申请号为PCT/US2012/024020)，专利技术名称为“脂蛋白复合物及其制备和用途”的专利申请的分案申请。1.相关申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2011年2月7日提交的临时申请61/440,371、2011年3月14日提交的临时申请61/452,630以及2011年5月17日提交的临时申请61/487,263的益处，将所有这些申请的全部内容通过引用的方式并入本申请。2.
本公开提供了脂蛋白复合物、包含所述复合物的药物组合物、产生并纯化用于所述复合物的载脂蛋白的方法、制备所述复合物的方法以及使用所述复合物治疗或者预防心血管疾病、与其相关的障碍和/或者病症的方法。3.
技术介绍
3.1.综述循环的胆固醇经由血液中转运脂质的、脂质与蛋白质组成的血浆脂蛋白复合物颗粒运送。血浆中循环的脂蛋白颗粒具有以下四种主要类别并且均包括在脂肪转运系统中：乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒构成了肠内脂肪吸收的短寿命产物。VLDL尤其是LDL负责将胆固醇由肝(胆固醇在肝中合成或由饮食来源获得)递送至肝外的组织，包括动脉壁。相反，HDL介导胆固醇的逆转运(RCT)，胆固醇脂质的去除，具体地，由肝外组织至肝，胆固醇在肝中储存、分解代谢、消除或再循环。HDL在炎症、转运氧化的脂质和白细胞介素中也起有益作用。脂蛋白颗粒具有包含胆固醇(通常为胆固醇酯的形式)和甘油三酯的疏水核。该核为包含磷脂、未酯化的胆固醇和载脂蛋白的表层所围绕。载脂蛋白介导脂质转运，并且载脂蛋白中的一部分可与脂质代谢中涉及的酶相互作用。已经鉴别了至少十种载脂蛋白，其包括：ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V、ApoB、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、ApoJ和ApoH。还发现其它蛋白质如LCAT(卵磷脂：胆固醇酰基转移酶)、CETP(胆固醇脂转移蛋白)、PLTP(磷脂转移蛋白)和PON(对氧磷酶)也与脂蛋白有关。心血管疾病，如冠心病、冠状动脉疾病和动脉粥样硬化在极大程度上与血清中升高的胆固醇浓度有关。例如，动脉粥样硬化是一种缓慢进展型疾病，其经由动脉壁内胆固醇的蓄积而表征。令人信服的证据支持以下理论：在动脉粥样硬化病变中沉积的脂质主要来自于血浆LDL；因此，LDL已被普遍地认为是“有害的”胆固醇，相反，HDL血清浓度与冠心病成反比。事实上，HDL的较高血清浓度被认为是负向的风险因素。据假设，较高浓度的血浆HDL不仅保护性地对抗冠状动脉疾病，而且实际上可以诱导动脉粥样硬化斑块的消退(参见，例如，Badimonetal.,1992,Circulation86(Suppl.III):86-94；DanskyandFisher,1999,Circulation100:1762-63；Tangiralaetal.,1999,Circulation100(17):1816-22；Fanetal.,1999,Atherosclerosis147(1):139-45；Deckertetal.,1999,Circulation100(11):1230-35；Boisvertetal.,1999,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(3):525-30；Benoitetal.,1999,Circulation99(1):105-10；Holvoetetal.,1998,J.Clin.Invest.102(2):379-85；Duvergeretal.,1996,Circulation94(4):713-17；Miyazakietal.,1995,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.15(11):1882-88；Mezdouretal.,1995,Atherosclerosis113(2):237-46；Liuetal.,1994,J.LipidRes.35(12):2263-67；Plumpetal.,1994,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(20):9607-11；Pasztyetal.,1994,J.Clin.Invest.94(2):899-903；Sheetal,1992,Chin.Med.J.(Engl).105(5):369-73；Rubinetal.,1991,Nature353(6341):265-67；Sheetal.,1990,Ann.NYAcad.Sci.598:339-51；Ran,1989,ChungHuaPingLiHsuehTsaChih(还翻译为：ZhonghuaBingLiXueZaZhi)18(4):257-61；Quezadoetal.,1995,J.Pharmacol.Exp.Ther.272(2):604-11；Duvergeretal.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(12):1424-29；Kopfleretal.,1994,Circulation；90(3):1319-27；Milleretal.,1985,Nature314(6006):109-11；Haetal.,1992,Biochim.Biophys.Acta1125(2):223-29；Beitzetal.,1992,ProstaglandinsLeukot.Essent.FattyAcids47(2)：149-52)。作为结论，HDL已被普遍认为是“有利的”胆固醇(参见，例如，Zhang,etal.,2003Circulation108:661-663)。HDL的“保护性”作用在大量研究中得以证实(例如,Milleretal.,1977,Lancet1(8019):965-68；Whayneetal.,1981,Atherosclerosis39:411-19)。在这些研究中，LDL升高的浓度似乎与增加的心血管风险相关，而较高的HDL浓度好像具有心血管保护作用。体内研究已经进一步证明了HDL的保护作用，其显示注入兔中的HDL可以阻碍胆固醇诱发的动脉病变的形成(Badimonetal.,1989,Lab.Invest.60:455-61)和/或者可以诱导所述动脉病变消退(Badimonetal.,1990,J.Clin.Invest.85:1234-41)。3.2.胆固醇逆转运、HDL和载脂蛋白A-I胆固醇逆转运(RCT)通路起消除来自肝外大部分组织的胆固醇的作用并且对于维持机体内大部分细胞的结构和功能至关重要。RCT主要由以下三个步骤组成：(a)胆固醇外流，即，胆固醇最初由不同的外周细胞池的去除；(b)经由卵磷脂:胆固醇酰基转移酶(LCAT)的作用进行的胆固醇酯化，从而防止外流的胆固醇再次进入细胞中；以及(c)将HDL-胆固醇和胆固醇酯摄取至肝细胞进行水解，然后进行再循环、贮存、在胆汁中分泌或代谢成胆酸。LCAT(RCT中的关键酶)由肝产生并在与HDL成分缔合的血浆中进行循环。LCAT将源自细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂蛋白复合物的群体，其各自包含脂质部分和载脂蛋白部分，所述载脂蛋白部分基本上由载脂蛋白A‑I(“ApoA‑I”)构成，其中如由凝胶渗透色谱法中的单峰所反映，所述脂蛋白复合物为至少80％均质的、至少85％均质的、至少90％均质的或者至少95％均质的。

【技术特征摘要】
2011.02.07 US 61/440,371;2011.03.14 US 61/452,630;1.脂蛋白复合物的群体，其各自包含脂质部分和载脂蛋白部分，所述载脂蛋白部分基本上由载脂蛋白A-I(“ApoA-I”)构成，其中如由凝胶渗透色谱法中的单峰所反映，所述脂蛋白复合物为至少80％均质的、至少85％均质的、至少90％均质的或者至少95％均质的。2.权利要求1的组合物，其特征还在于以下特征中的一、二、三或者四种：(a)如经凝胶渗透色谱法(“GPC”)或者动态光散射(“DLS”)所测量，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的所述脂蛋白复合物为具有以下粒度的颗粒的形式：4nm至15nm、6nm至15nm、4nm至12nm、6nm至12nm或者8nm至12nm；(b)在所述群体中至少75wt％、至少80wt％、至少85wt％、至少90wt％或者至少95wt％的ApoA-I为成熟形式；(c)在所述群体中不超过25wt％、不超过20wt％、不超过15wt％、不超过10wt％或者不超过5wt％的ApoA-I为不成熟形式；和(d)在所述群体中不超过25wt％、不超过20wt％、不超过15wt％、不超过10wt％或者不超过5wt％的ApoA-I为截短形式。3.权利要求1或者2的组合物，其特征还在于以下特征中的一、二、三、四或者五种：(a)在所述群体中所述ApoA-I中的不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过3％、不超过2％或者不超过1％的蛋氨酸112和蛋氨酸148各自被氧化；(b)在所述群体中所述ApoA-I的不超过15％、不超过10％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％或者不超过1％的氨基酸被脱去酰胺；(c)所述群体含有不超过1EU内毒素/毫克ApoA-I、不超过0.5EU内毒素/毫克ApoA-I、不超过0.3EU内毒素/毫克ApoA-I或者不超过0.1EU内毒素/毫克ApoA-I；(d)所述群体含有不超过100皮克宿主细胞DNA/毫克ApoA-I、不超过50皮克宿主细胞DNA/毫克ApoA-I、不超过25皮克宿主细胞DNA/毫克ApoA-I、不超过10皮克宿主细胞DNA/毫克ApoA-I或者不超过5皮克宿主细胞DNA/毫克ApoA-I；和(e)所述群体含有不超过500纳克宿主细胞蛋白/毫克ApoA-I、不超过200纳克宿主细胞蛋白/毫克ApoA-I、不超过100纳克宿主细胞蛋白/毫克ApoA-I、不超过50纳克宿主细胞蛋白/毫克ApoA-I或者不超过20纳克宿主细胞蛋白/毫克ApoA-I。4.权利要求1-3中任一项的群体，其中在所述复合物的脂质部分中不超过15wt％、不超过10wt％、不超过5wt％或者不超过2wt％的脂质为胆固醇。5.权利要求1-4中任一项的群体，其中所述ApoA-I为人ApoA-I蛋白。6.权利要求1-5中任一项的群体，其中所述ApoA-I为重组ApoA-I。7.权利要求1-6中任一项的群体，其中所述脂质部分基本上由95至99wt％的中性磷脂和1至5wt％的负电荷磷脂构成。8.权利要求7的群体，其中所述脂质部分基本上由96至98wt％的中性磷脂和2至4wt％的负电荷磷脂构成。9.权利要求1-8中任一项的群体，其中所述脂质部分基本上由97wt％的中性磷脂和3wt％的负电荷磷脂构成。10.权利要求9的群体，其中所述中性脂质为天然鞘磷脂或者合成鞘磷脂，任选地其中所述脂质具有小于5meqO/kg、小于4meqO/kg、小于3meqO/kg或者小于2meqO/kg的过氧化值。11.权利要求10的群体，其中所述鞘磷脂为蛋-鞘磷脂。12.权利要求9-11中任一项的群体，其中所述负电荷磷脂包括磷脂酰甘油。13.权利要求12的群体，其中所述负电荷磷脂包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](DPPG)的盐或者由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[-磷酸-外消旋-(1-甘油)](DPPG)的盐构成。14.权利要求1-13中任一项的群体，其具有范围为1:2至约1:3的载脂蛋白部分与磷脂部分的重量比。15.组合物，其包含权利要求1-14中任一项的二个、三个或者四个群体。16.权利要求15的组合物，其中所述组合物中的不超过15％、不超过12％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％的脂蛋白为非复合形式。17.权利要求15或者16的组合物，其中所述组合物中的不超过15％、不超过12％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％的脂质为非复合形式。18.权利要求15-17中任一项的组合物，其包含第一群体，所述第一群体包含在每个脂蛋白复合物中具有2个ApoA-I分子或者ApoA-I等价物的脂蛋白复合物。19.权利要求18的组合物，其包含第二群体以及任选的第三群体，各自地，所述第二群体包含在每...

【专利技术属性】
技术研发人员：JL达塞尤克斯，DC奥尼西奥，R阿克曼，
申请(专利权)人：塞勒尼斯医疗控股公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR