一种含抗冻蛋白的细胞冻存液制造技术

该发明专利技术涉及细胞冷冻液领域，具体涉及一种含抗冻蛋白的细胞冻存液。本发明专利技术在细胞冷冻液中添加AFP134蛋白，可有效的提高细胞复苏率，不含DMSO，降低DMSO对细胞毒性影响。

A cell cryopreservation solution containing antifreeze protein

The invention relates to the field of cell freezing fluid, in particular to a cell antifreeze solution containing antifreeze protein. The present invention adds AFP134 protein into the cell frozen liquid, which can effectively improve the cell recovery rate, without DMSO, and reduce the influence of DMSO on the cytotoxicity.

【技术实现步骤摘要】
一种含抗冻蛋白的细胞冻存液
本专利技术涉及细胞冻存液领域，具体涉及一种含抗冻蛋白的细胞冻存液。
技术介绍
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中超低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。在超低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用冷冻保护剂。二甲基亚砜(DMSO)是一种重要的渗透型细胞保护剂，DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，是目前常用细胞冻存液的主要成分。但DMSO是有人体和细胞毒性的，并能使细胞产生形态分化。研究表明培养液中DMSO浓度为10％时,细胞生长抑制率近100％；1‰浓度时抑制率为35％；即使是0.04‰的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因。
技术实现思路
本专利技术的目的一种不含DMSO的细胞冻存液。使用抗冻蛋白AFP134替代DMSO，以提高细胞复苏率，降低细胞毒性，保护细胞株的原始特性。
技术实现思路
如下：一种细胞冻存液，其组分包括：AFP134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬酸钠、灭菌双蒸水。进一步的，AFP134抗冻蛋白终浓度为0.01mg/ml，小牛血清终浓度为90％，蔗糖终浓度0.5M/L，柠檬酸钠终浓度为0.05M/L。进一步的，AFP134抗冻蛋白质量浓度为0.5g/L-2g/L，蔗糖质量浓度为10g/L-20g/L，柠檬酸钠质量浓度为1g/L-3g/L，小牛血清的体积分数为70％-95％。一种细胞冻存液的应用，包括如下步骤：A、细胞冻存(1)取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗；(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；(3)离心1000rpm，离心5min；(4)去除胰蛋白酶，加入配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；(5)将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；(6)冻存：降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中；也可将装有细胞的冻存管放入-20℃保存2h，然后放入-70℃冰箱中保存12h，取出冻存管，移入液氮容器内；B、细胞复苏(1)从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；(3)离心，转速1000rpm，时间为5min；(4)弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；(5)次日更换一次培养液，继续培养。抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)具有阻止冰晶形成的功能。AFP134具有冰晶亲和力，能够降低冰晶形成温度，而不影响溶解温度，此外，AFP134利用自身冰晶亲和面与冰晶结合，从而阻止或抑制冰晶的生长。AFP134还能能够阻止冰的再结晶，从而避免细胞受到由冰晶导致的机械性损伤。本专利技术所述的细胞抗冻液需在-20℃保存，保质期一年。附图说明：图1是使用本专利技术细胞冻存液冻存细胞复苏效果；图2是使用不含AFP134和DMSO的对照溶液冻存后的复苏效果。具体实施方式：(一)冻存液配制：称取AFP134(终浓度0.01mg/ml)1mg、小牛血清(终浓度90％)90ml、蔗糖(终浓度0.5M/L)17g、柠檬酸钠(终浓度0.05M/L)1.47g将上述物质加入到90ml灭菌双蒸水中，定容至100ml(二)细胞冻存1.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。2.去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管1.2ml；6.冻存：冻存程序为降温速率--2℃/min；当温度达-25℃以下时，增至-8℃/min；到-100℃时，则迅速浸入液氮中。(三)细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加12倍培养液，混匀；3.离心，1000rpm，5min；4.弃去上清液，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5.次日更换一次培养液，继续培养。附图说明：图1是使用本专利技术细胞冻存液冻存细胞复苏效果，图2是使用不含AFP134和DMSO的对照溶液冻存后的复苏效果。由图1、图2对比可知，采用本专利技术的细胞冻存液冻存细胞，细胞复苏率高，能保持细胞株的原始特性。以上所述仅为本专利技术的较佳实施例，凡在本专利技术的原则之内，所作的任何修改、改进、替换等，应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：AFP134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬酸钠、灭菌双蒸水。

【技术特征摘要】
1.一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：AFP134抗冻蛋白、小牛血清、蔗糖、柠檬酸钠、灭菌双蒸水。2.如权利要求1所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，所述AFP134抗冻蛋白终浓度为0.01mg/ml，小牛血清终浓度为90％，蔗糖终浓度0.5M/L，柠檬酸钠终浓度为0.05M/L。3.如权利要求1-2所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液，其特征在于，所述AFP134抗冻蛋白质量浓度为0.5g/L-2g/L，蔗糖质量浓度为10g/L-20g/L，柠檬酸钠质量浓度为1g/L-3g/L，小牛血清的体积分数为70％-95％。4.如权利要求1所述的一种含抗冻蛋白的细胞冻存液的应用，其特征在于，包括如下步骤：A、细胞冻存(1)取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗；(2)去除PBS，加入适量胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来；(3)离心1000rpm，离心5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，奎翔，易晓佳，
申请(专利权)人：昆明医科大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：云南,53