本发明专利技术公开了一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒。本发明专利技术还公开了一种抑制HMGN1、P3H2和NOLC1基因表达的siRNA分子，所述的siRNA分子在制备治疗脊柱侧弯药物组合物中的应用。利用HMGN1、P3H2和NOLC1基因检测脊柱侧弯不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。
An early detection kit for scoliosis and its application
The invention discloses an early auxiliary detection kit for scoliosis. The present invention also discloses a siRNA molecule that inhibits the expression of HMGN1, P3H2 and NOLC1 genes, and the application of the siRNA molecule in the preparation of a medication composition for scoliosis. The use of HMGN1, P3H2 and NOLC1 gene detection of scoliosis can quickly and effectively achieve the early diagnosis, but also for the prediction and diagnosis of the occurrence and development of AIS, even for the future in the biological treatment level of AIS provides an important basis for therapeutic targets and.
【技术实现步骤摘要】
一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用。
技术介绍
脊柱侧弯(Scoliosis)，又称脊柱侧凸，是一类以脊柱侧方弯曲并伴有椎体旋转的复杂三维脊柱畸形。根据发病原因，可将其分为3大类：先天性脊柱侧弯、综合症性脊柱侧弯和特发性脊柱侧弯。先天性脊柱侧弯是由脊柱发育畸形导致的；综合症性脊柱侧弯是由神经肌肉疾病、骨骼疾病、结缔组织疾病和神经纤维瘤病等导致的；特发性脊柱侧弯确切病因尚不清楚，相关研究认为基因遗传因素、生长发育和激素、结缔组织病变、肌肉系统的异常、中枢神经系统异常、褪黑素的作用等都可能与AIS的发病有关。其中，青少年特发性脊柱侧弯(AdolescentIdiopathicScoliosis，AIS)最为常见，占整个脊柱侧弯的80％。青少年特发性脊柱侧弯在10岁-16岁青少年中的发病率较高，是继视力异常、肥胖、包茎和社会心理障碍后的第五大常见病。虽然AIS除表现畸形外通常不引起严重的病理状态，但是重度胸弯可能引起心、肺功能的减退，导致明显的体型上的畸形，甚至影响寿命。目前治疗方法主要是针对畸形进行矫治，包括临床观察、支具治疗和对侧弯超过45°者进行手术治疗，治疗复杂，常遗留有脊柱畸形和脊柱活动障碍，效果不理想。同时，AIS患者如果不进行筛查，在初次就诊时主弯平均角度为38°，已经接近进行支具治疗的上限。因此，对AIS的早期筛查和诊断可以为患者争取更多保守治疗的机会，减少手术几率。目前AIS的诊断与筛查主要还是依靠对患者外观对称性的体格检查和影像学检查，这会使很多低风险的青少年接受不必要的放射学检查，而且这种筛查手段特异性较差。随着医学遗传学和医学分子生物学研究的不断深入和进步，AIS的医学分子生物学机制的研究也陆续被报道。在对AIS进行分子生物学研究的过程中发现了一些与其相关的生物标记物，如钙调蛋白、外周血中瘦素、血清骨桥蛋白、可溶性CD44、SH3GL1等，但效果和结论仍需进一步验证。因此，从基因表达水平上去研究AIS病因，继续寻找新的、特异性好的AIS早期筛查与诊断的标记物具有重要意义。
技术实现思路
为了实现青少年特发性脊柱侧弯的早期发现，早期治疗，本专利技术的目的在于提供一种用于脊柱侧弯早期筛查的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种抑制HMGN1基因和/或P3H2基因和/或NOLC1基因表达的siRNA分子，以及所述siRNA在在制备治疗脊柱侧弯药物组合物中的应用。为实现上述目的，本专利技术首先提供一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒，其包括检测样本中HMGN1基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。优选的，所述试剂盒还包括用于检测P3H2基因的引物包括如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。优选的，所述试剂盒还包括用于检测NOLC1基因的引物包括如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。优选的，所述试剂盒还包括：(1)组织样本或血液中总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇和75％乙醇等。(2)反转录试剂：逆转录缓冲液、逆转录酶、热稳定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制剂、OligodTPrimer和Random6mers。(3)定量PCR试剂：PCR缓冲液、SYBRGreen荧光染料、dNTPs组成的SYBRGreen聚合酶链式反应体系和RNaseFreeH2O。优选的，所述试剂盒含有阳性对照和阴性对照。优选地，所述阳性对照为正常人血液RNA或DNA，所述阴性对照为ddH2O。优选的，所述试剂盒利用real-timePCR检测样本中HMGN1基因和/或P3H2基因和/或NOLC1基因的表达水平，所述HMGN1、P3H2和NOLC1基因在生物学样品中表达上调。进一步地，本专利技术提供了一种抑制HMGN1基因表达的siRNA分子，所述siRNA分子为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10。进一步地，本专利技术还提供了一种抑制P3H2基因表达的siRNA分子，所述siRNA分子为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12。进一步地，本专利技术还提供了一种抑制NOLC1基因表达的siRNA分子，所述siRNA分子为SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。更进一步地，本专利技术提供了所述siRNA分子在制备治疗脊柱侧弯药物组合物中的应用。优选的，所述药物包括通过干扰RNA抑制HMGN1基因和/或P3H2基因和/或NOLC1基因表达的双链核糖核酸或用于抑制HMGN1和/或P3H2和/或NOLC1蛋白活性的蛋白质。在本专利技术中，所述RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和许多疾病的基因治疗领域中。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易上调或沉默任何目的基因的表达。为了确保HMGN1基因和/或P3H2基因和/或NOLC1基因能够被高效剔除或沉默，根据HMGN1基因和/或P3H2基因和/或NOLC1基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA通过在线工具设计完成，该在线工具为http://sidirect2.rnai.jp/，siRNA寡核苷酸由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。优选地，所述药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。优选的，所述药物还可与其他脊柱侧弯的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。优选的，所述脊柱侧弯为青少年特发性脊柱侧弯。本专利技术的有益效果如下：本专利技术公开了一种与脊柱侧弯相关的基因HMGN1、P3H2和NOLC1，并进一步证实HMGN1、P3H2和NOLC1基因或其表达蛋白在青少年特发性脊柱侧弯患者生物学样品中表达上调。利用HMGN1、P3H2和NOLC1基因在青少年中进行脊柱侧弯的普查，解决了现有技术中诊断措施敏感性和特异性差的问题，也减少了X线辐射的损害，能够快速有效的做到AIS的早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1本专利技术中实施例2中脊柱侧弯患者HMGN1、P3H2和NOLC1基因表达上调。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。本专利技术的技术方案具体包括：对20例青少年特发性脊柱侧弯患者样本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒，其特征在于，其包括检测样本中HMGN1基因的引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒，其特征在于，其包括检测样本中HMGN1基因的引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测P3H2基因的引物包括如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测NOLC1基因的引物包括如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。4.一种抑制HMGN1基因表达的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子为SEQIDNO:9和SEQIDNO:...
【专利技术属性】
技术研发人员：王耀，贾冰寒，李睿，
申请(专利权)人：北京赛尔维康生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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