黄瓜－酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法。将甜瓜属双二倍体新种与二倍体黄瓜正反杂交获得的甜瓜属异源三倍体与二倍体栽培黄瓜进行回交，获得黄瓜‑酸黄瓜异附加系候选材料。将黄瓜着丝粒特异的重复序列Type III标记探针。取黄瓜‑酸黄瓜异附加系候选材料根尖进行酶解，火焰干燥法制片，获得分散度良好的中期染色体制片。将黄瓜着丝粒特异重复序列Type III探针变性后杂交到变性的中期染色体制片上，利用高严谨度的杂交条件，使得Type III产生清晰可辨的荧光信号，从而鉴定出黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料及其附加酸黄瓜染色体的数目。本发明专利技术黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，为异附加系材料中野生酸黄瓜优异基因的转移，培育黄瓜新品种创造了条件。

Identification methods of cucumber Sour Cucumber Alien Addition Lines

The invention discloses a method for identification of cucumber pickled cucumbers additional lines materials. A new species of amphidiploid muskmelon and cucumber and muskmelon hybrid diploid genera were backcrossed with diploid allotriploid cucumber, pickled cucumbers get Cucumber Alien additional lines of candidate materials. Cucumber centromere repeats Type III labeled probe. Take the cucumber pickled cucumbers alien additional lines of candidate materials root of enzymolysis, flame drying method, obtained good dispersed metaphase chromosome. Cucumber centromere specific repetitive sequence of Type III probe hybridized to denatured metaphase chromosome degeneration, using high stringency hybridization conditions, the fluorescence signal makes Type III clear, which identified the number of cucumber pickled cucumbers alien addition line material and the additional chromosome of pickled cucumbers. Identification method of the invention cucumber pickled cucumbers additional lines of materials, for the transfer of wild pickled cucumbers excellent gene additional lines in the material, cultivating new varieties of cucumber to create conditions.

【技术实现步骤摘要】
黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法一、
本专利技术公开了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，有利于开展黄瓜育种研究，属于植物生物
二、技术背景黄瓜(CucumissativusL.，2n＝2x＝14)属于葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis)物种，是世界性的重要蔬菜作物。黄瓜遗传基础非常狭窄，种内缺乏重要抗性基因，现有的栽培品种对病害、高低温逆境等生物和非生物胁迫普遍较为敏感，因此通过种间杂交转移利用野生资源的抗性性状对于黄瓜改良尤其重要(Dijkhuizenetal.，1994；Staubetal.，2005)。黄瓜近缘野生资源丰富，所属的甜瓜属包含50多种野生物种(Sebastianetal.，2010)。但因物种的分化(黄瓜是该属唯一染色体基数为7的物种，其它物种染色体基数均为12)，黄瓜与野生近缘种间杂交成功的报道迄今仅有一例：Chen等于2000年首次成功实现黄瓜与近缘野生种---酸黄瓜(C.hystrixL.，2n＝2x＝24)的种间杂交，并进一步染色体加倍获得种间异源四倍体C.hytivusChen&Kirkbride(2n＝4x＝38)，为黄瓜的种间改良开创了新途径。酸黄瓜携带有多种抗病抗逆性状，如抗线虫、蔓枯病、霜霉病、耐弱光等(曹清河etal.，2005；陈劲枫etal.，2001)。前期基于该种间异源四倍体，通过连续回交，获得了多份包括异源三倍体和渐渗系等异染色体系材料(Chenetal.，2003；孟佳丽等，2012)。然而，充分有效地挖掘野生酸黄瓜基因组有用信息需要借助于更多特定的材料，异附加系由于将酸黄瓜染色体附加到黄瓜遗传背景的不同个体中，可为酸黄瓜有用基因的遗传解析及相关研究提供优良的材料。传统的鉴定异附加系外源染色体的方法主要包括形态学、细胞学C分带、生化标记法(如同工酶)等(谭光轩，2008；董凤高等，1992)。荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)结合分子标记技术的发展为附加系外源染色体的鉴定提供了直观而有力的手段(Anetal.，2015)。目前，关于黄瓜-酸黄瓜异附加系材料附加酸黄瓜染色体的鉴定方法未见报道。因酸黄瓜染色体特异性探针的缺乏，我们利用黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列TypeIII作为探针与附加系材料的中期染色体进行杂交，根据杂交信号的有无，成功的鉴定出黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列TypeIII的荧光原位杂交技术鉴定了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目，是针对以往附加系材料鉴定方法的繁琐等不足以及缺乏的酸黄瓜染色体特异的识别标记，专利技术了一种仅通过黄瓜着丝粒特异重复序列TypeIII的荧光原位杂交(FISH)即可快速识别出附加的酸黄瓜染色体及其数目。技术方案本专利技术所提供的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，其实施方案如下：1)甜瓜属异源三倍体黄瓜比二倍体栽培黄瓜提早一个月种植，使二者花期相遇；2)以甜瓜属异源三倍体黄瓜为母本，二倍体栽培黄瓜为父本杂交，3朵雄花授一朵雌花；3)杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；4)将杂交获得的种子催芽播种，待苗子长大后，取好的根尖于0.002M的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，备用；5)采用缺刻平移法将黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列TypeIII用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)标上探针，具体操作根据探针标记试剂盒说明，备用；6)采用4％纤维素酶和2％果胶酶混合液，酶解黄瓜-酸黄瓜异附加系材料根尖，利用火焰干燥法制作黄瓜染色体制片，镜检，挑选染色体分散度高的制片，备用；7)将20μL杂交混合液(含有50ng标记好的TypeIII探针、50％去离子甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖)杂交到黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中期染色体上，反应12h后，2×SSC洗片，加上带有荧光基团的抗Digoxigenin抗体进行反应1h，高严谨条件洗脱后，DAPI进行染色体的复染，利用荧光显微镜检测信号，依据染色体荧光信号的有无，鉴定附加的酸黄瓜染色体及附加染色体的数目。有益效果本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：1)利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列TypeIII的荧光原位杂交技术鉴定了黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加的酸黄瓜染色体及其数目，与现有技术相比，具有直观性，充分提高了试验效率。2)现有的鉴定附加系材料的方法，主要利用细胞学C分带、生化标记法(如同工酶)等，在特定的一些物种中如小麦、棉花等作物的附加系鉴定中较多的应用基因组荧光原位杂交技术(GISH)。在黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定中，细胞学C分带、生化标记法(如同工酶)等方法操作繁琐。与之相比利用黄瓜染色体着丝粒特异重复序列TypeIII作为探针来鉴定附加系材料，直观、明确、简单。3)在材料准备方面，制作分散度高的片子，这样可以使杂交上去的探针信号更加清晰，更容易识别染色体数目，加快了实验进程。4)作为探针的黄瓜染色体着丝粒特异重复序列TypeIII，在染色体上拷贝数多，信号容易凸显，使得目标探针信号在染色体上清晰可辨。四、附图说明图1：黄瓜着丝粒特异的探针TypeIII鉴定的附加1条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针TypeIII信号清晰。图2：黄瓜着丝粒特异的探针TypeIII鉴定的附加2条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针TypeIII信号清晰。图3：黄瓜着丝粒特异的探针TypeIII鉴定的附加3条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针TypeIII信号清晰。图4：黄瓜着丝粒特异的探针TypeIII鉴定的附加5条酸黄瓜染色体的黄瓜-酸黄瓜异附加系材料，红色标记的着丝粒特异的探针TypeIII信号清晰。五、具体实施方式本专利技术黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法的实施程序包括：1)附加系材料的创制：甜瓜属异源三倍体黄瓜比二倍体栽培黄瓜提早一个月种植，使二者花期相遇；以甜瓜属异源三倍体黄瓜为母本，二倍体栽培黄瓜为父本杂交，3朵雄花授一朵雌花；杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；2)材料的准备：将杂交获得的种子催芽播种，待苗子长大后，取好的根尖于0.002M的8-羟基喹啉溶液中25℃预处理3h，以富集中期分裂细胞，再放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中固定至少24小时，备用；3)探针的制备：黄瓜染色体着丝粒特异重复序列TypeIII探针的标记采用缺刻平移法。根据探针标记试剂盒说明，用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)将重复序列TypeIII标上探针，备用。4)酶解根尖：利用4％纤维素酶和2％果胶酶混合溶液，于37℃酶解根尖约1h，后将酶解好的根尖固定于上述固定液中备用。5)制片：取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100μL的固定液，在酒精灯上烧片干燥制片。6)探针的本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，其特征如下：黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料是通过甜瓜属异源三倍体与二倍体栽培黄瓜回交获得。利用黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列Type III作为探针，通过荧光原位杂交(FISH)即可对黄瓜‑酸黄瓜异附加系材料中附加酸黄瓜的染色体及其数目进行准确鉴定。

【技术特征摘要】
1.黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定方法，其特征如下：黄瓜-酸黄瓜异附加系材料是通过甜瓜属异源三倍体与二倍体栽培黄瓜回交获得。利用黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列TypeIII作为探针，通过荧光原位杂交(FISH)即可对黄瓜-酸黄瓜异附加系材料中附加酸黄瓜的染色体及其数目进行准确鉴定。2.根据权利要求1所述的利用黄瓜染色体着丝粒特异的重复序列TypeIII作为探针，对黄瓜-酸黄瓜异附加系材料的鉴定，是通过以下方法完成的：1)甜瓜属异源三倍体黄瓜比二倍体栽培黄瓜提早一个月种植，使二者花期相遇；2)以甜瓜属异源三倍体黄瓜为母本，二倍体栽培黄瓜为父本杂交，3朵雄花授一朵雌花；3)杂交授粉35-40天后，采收发育成熟果实中的种子；4)将杂交获得的种子催芽播种，待苗子长至2片真叶至4片...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄群峰，李子昂，毕云飞，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32