一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及丝蛋白提取领域，公开了一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，具体为：采用碱法脱胶对桑蚕丝进行处理，得到丝素纤维；将丝素纤维与预先制备的离子液体和PEG‑碱性蛋白酶进行混合，利用碱性蛋白酶和离子液体同时对丝素蛋白进行溶解，通过加入无水乙醇去除离子液体，使得到的丝素蛋白再次溶解在去离子水中，通过透析和冷冻干燥即可得到纯净的丝素蛋白粉末。这种桑蚕丝丝素蛋白的提取方法具有反应条件温和、化学试剂用量少、离子液体可回收，可对桑蚕丝丝素蛋白进行有效溶解。

A method for extracting silkworm fibroin protein by ionic liquid and protease

The invention relates to the field of extraction of silk protein, discloses a method using ionic liquid and protease extraction of Bombyx silk fibroin protein specifically: degumming of silk treated by alkali method, obtained silk fibroin fiber; silk fibroin fibers are mixed with the pre prepared ionic liquids and PEG alkaline protease, and hormone protein of silk was dissolved with alkaline protease and ionic liquid, by adding ethanol to remove ionic liquids, the silk fibroin again dissolved in deionized water by dialysis and freeze-drying to obtain pure silk fibroin powder. The extraction method of Bombyx mori silk fibroin has mild reaction conditions, less chemical reagent and recyclable ionic liquid, which can effectively dissolve mulberry silk fibroin.

【技术实现步骤摘要】
一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法
本专利技术涉及丝蛋白提取领域，尤其涉及一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法。
技术介绍
蚕丝是一种动物蛋白纤维材料，主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，其中丝素蛋白约占70%，是蚕丝的主要成分。丝胶和丝素具有不同的结构和性能：丝胶为球状蛋白，组成氨基酸中含有大量极性亲水侧基，且二级结构以无规卷曲为主，稳定性差，可溶于热水、酸、碱、蛋白酶以及低浓度碳酸钠等溶液中；而丝素为纤维状蛋白，性能稳定，天然丝素纤维含有大量分子内和分子间氢键,结晶度较高而难溶解于一般溶剂。目前，在研究过程中，常采用强酸、强碱、高浓度的盐溶液如高浓度CaCl2溶液、铜氨溶液、溴化锂溶液、硫氰化锂溶液等对蛋白质溶解,但这些溶剂存在对蛋白质分子降解严重、有毒害、不稳定、不易回收等缺点。离子液体(IL)是近年来兴起的一类极具应用前景的绿色溶剂,广泛应用于电化学、有机合成、化工分离、材料制备等领域。所谓的离子液体就是在室温（或者稍高于室温的温度）下呈液态的离子体系，或者说，离子液体是仅由离子所组成的液体。在组成上，它与我们概念中的“盐”相近，而其熔点通常又低于室温，所以，也有人把离子液体叫做“室温熔融盐”，离子液体通常是有机盐，可以当作有机溶剂使用在研究过程中。与常见的有机溶剂不同，离子液体中存在强大的静电相互作用，因此表现出非同寻常特点：非挥发性、液程宽、高热容、高稳定性、宽的电化学窗口、良好的导电与导热性、良好的透光性与高折光率、选择性溶解力与可设计性。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法。本专利技术的提取方法较为温和，对丝素蛋白损伤小，使用原料环保，无毒害，且提取效率较高。本专利技术的具体技术方案为：一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，以g和mL计，包括如下步骤：1）称取3.5-4.5g桑蚕丝，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。2）将烘干的桑蚕丝以1:90-110的浴比在含有0.4-0.6wt%的Na2PO4和0.8-1.2wt%的C17H35COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次。脱胶过程中，随着丝胶的水解，溶液中氨基酸的浓度逐渐增加，pH降低，脱胶效率减弱，所以需加碱以维持脱胶液pH值的稳定，但碱浓度过大会损伤丝素，所以采用C17H35COONa作为缓冲剂。3）脱胶之后，将桑蚕丝用去离子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。4）称取1.8-2.2g干燥的丝素纤维，以1:35-45的浴比浸入1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.10-0.20g，在40~55℃的油浴中搅拌6~8h，得到丝素/离子液体溶液后，进行灭酶。生物酶是一种无毒无害、与环境友好的催化剂，拥有高效的特异性；且用量少，水解条件（温度、pH）温和，减少污染，节约资源。离子液体(IL)是近年来兴起的一类极具应用前景的绿色溶剂，对丝素蛋白表现出一定的溶解性。本专利技术采用PEG对碱性蛋白酶进行修饰，以保持碱性蛋白酶在离子液体中的稳定性和活性。碱性蛋白酶本身也是一种蛋白质，离子液体对其结构具有一定的破坏作用，利用PEG处理碱性蛋白酶，借助PEG链对IL的亲和性，不仅可以使酶均匀的分散在IL中，同时也会提高酶的稳定性，同时保证酶在离子液体中的活性。5）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将过滤液装入透析袋中透析20-28h，得到纯净的丝素蛋白溶液。6）对丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。作为优选，步骤4）中，所述PEG-碱性蛋白酶的制备方法为：分别称取碱性蛋白酶0.10-0.20g，PEG0.15-0.20g，K2HPO40.14-0.18g，将其溶解于8-12mL去离子水中，40~55℃保温1.5-2.5h，经冷冻干燥90-100h后，得到PEG-碱性蛋白酶粉末。作为优选，所述PEG为1000MW聚乙二醇。作为优选，在PEG-碱性蛋白酶的制备过程中，冷冻干燥前，预先在-20℃条件下冷冻4h。作为优选，步骤4）中，所述1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体的制备方法为：在反应容器中加入2-甲基烯丙基氯和N-甲基咪唑，在75-85℃油浴中搅拌回流2-4h，反应完毕后，采用旋转蒸发除去过量的2-甲基烯丙基氯，得到1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体，冷冻干燥20-28h后，解冻备用。在上述方法中，必须对得到的产物进行冷冻干燥，除去离子液体中可能存在的水分。水是极性溶剂，带入部分氢键，和离子液体发生作用，从而会降低离子液体对丝素蛋白的溶解作用。作为优选，所述2-甲基烯丙基氯和N-甲基咪唑的投料摩尔比为1.4:1。需控制2-甲基烯丙基氯与N-甲基咪唑的摩尔比为1.4:1；此为最佳投料比，有利于提高N-甲基咪唑的选择性，提高产率；作为优选，步骤4）中，灭酶时，在80℃以上的油浴中保温至少30min。作为优选，步骤5）中，所述透析袋的截留分子量为3500。与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术利用PEG1000对碱性蛋白酶进行修饰，利用PEG对离子液体的亲和作用，不仅提高了酶的稳定性和反应活性，同时增加了酶在离子液体中的分散均匀性，有利于其对丝素蛋白的水解。（2）本专利技术在脱胶过程中，加入C17H35COONa作为缓冲剂，维持碱性环境，提高脱胶效率，同时减少对丝素纤维的伤害。（3）本专利技术利用生物酶和离子液体的双重溶解作用，同时对丝素蛋白进行处理，提高了丝素蛋白的溶解度。（4）本专利技术中，生物酶无毒无害、与环境友好，同时用量少，节约资源；特异性高，作用条件温和，对丝素蛋白的破坏小。而离子液体是“绿色溶剂”，环保无害，基团可设计，并且易于回收，可循环使用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。实施例1：一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，包括以下步骤：1）称取4g桑蚕丝作为样品，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干。2）将烘干的样品以1:100的浴比在含有0.5%Na2PO4和1%C17H35COONa的混合溶液中煮沸30min，进行脱胶处理，共脱胶两次。3）脱胶之后，将样品用去离子水搓洗4次以上，放入60℃烘箱，得到干燥的丝素纤维。4）称取2g干燥的丝素纤维，以1:40的浴比浸入离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.15g，在40℃的油浴中搅拌6h，得到丝素/离子液体溶液后，在80℃以上的油浴中保温至少30min，进行灭酶。5）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，会有丝素蛋白析出。将混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将溶液装入截留分子量3500的透析袋中透析24h，得到纯净丝素蛋白溶液。6）将得到的丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。其中，PEG-碱性蛋白酶的制备：称取碱性蛋白酶0.15g，PEG（1000MW聚乙二醇）0.17g，K2HPO4(磷酸氢二钾)0.16g，溶解在10mL去离子水中，40℃保温2h，然后在-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，其特征在于，以g和mL计，包括如下步骤：1）称取3.5‑4.5g桑蚕丝，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干；2）将烘干的桑蚕丝以1:90‑110的浴比在含有0.4‑0.6wt%的Na2PO4和0.8‑1.2wt%的C17H35COONa的混合溶液中煮沸25‑35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；3）脱胶之后，将桑蚕丝用去离子水搓洗4次以上，放入55‑65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维；4）称取1.8‑2.2g干燥的丝素纤维，以1:35‑45的浴比浸入1‑(2‑甲基)烯丙基‑3‑甲基咪唑氯盐离子液体中，同时加入PEG‑碱性蛋白酶粉末0.10‑0.20g，在40~55℃的油浴中搅拌6~8h，得到丝素/离子液体溶液后，进行灭酶；5）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将过滤液装入透析袋中透析20‑28h，得到纯净的丝素蛋白溶液；6）对丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。

【技术特征摘要】
1.一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，其特征在于，以g和mL计，包括如下步骤：1）称取3.5-4.5g桑蚕丝，用去离子水清洗，去除表面污染物，烘干；2）将烘干的桑蚕丝以1:90-110的浴比在含有0.4-0.6wt%的Na2PO4和0.8-1.2wt%的C17H35COONa的混合溶液中煮沸25-35min，进行脱胶处理，共脱胶两次；3）脱胶之后，将桑蚕丝用去离子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的丝素纤维；4）称取1.8-2.2g干燥的丝素纤维，以1:35-45的浴比浸入1-(2-甲基)烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体中，同时加入PEG-碱性蛋白酶粉末0.10-0.20g，在40~55℃的油浴中搅拌6~8h，得到丝素/离子液体溶液后，进行灭酶；5）待丝素/离子液体溶液冷却至室温，加入无水乙醇，反复浸泡，使丝素蛋白析出，对混合物进行真空抽滤，向滤出的丝素蛋白中加入去离子水，反复浸泡后过滤，再将过滤液装入透析袋中透析20-28h，得到纯净的丝素蛋白溶液；6）对丝素蛋白溶液进行冷冻干燥，即可得到丝素蛋白粉末。2.如权利要求1所述的一种利用离子液体和蛋白酶提取桑蚕丝丝素蛋白的方法，其特征在于，步骤1）中，所述PEG-碱性蛋白酶的制备方法为：分别称取碱性蛋白酶0.10-0.20g，PEG0.15-0.20g，K2HPO40.14-0.18g，将其溶解于8-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秉，陈茹茹，李津，梁军龙，郑浩然，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33