具有耐盐功能的基因DvRPT1、其编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种具有耐盐功能的基因

Salt resistant gene DvRPT1, its coding protein and its application

The present invention relates to a salt tolerant gene

【技术实现步骤摘要】
具有耐盐功能的基因DvRPT1、其编码蛋白及其应用
本专利技术涉及具有耐盐功能的基因DvRPT1、其编码蛋白及其应用。特别涉及一种绿色杜氏藻（Dunaliellaviridis）26S蛋白酶体调节亚基RPT1（RegulatoryParticleTriple-Aprotein1）DvRPT1基因的核苷酸序列、编码蛋白DvRPT1，及其在提高生物耐盐能力和在改良农作物性状中的应用。
技术介绍
杜氏藻属(Dunaliella)是自然界中广泛存在的一种无细胞壁的真核单细胞绿藻，广泛分布于盐湖、海洋等高盐水域，很容易从自然环境中分离得到。绿色杜氏藻（Dunaliellaviridis）是杜氏藻属中具有代表性的一个种。该种又称杜氏盐藻、盐生绿色杜氏藻等，它是已知最耐盐的真核生物。对环境具有极强的适应能力，可以适应0.05M-5.5MNaCl、8-35℃、pH6-9的生长条件。绿色杜氏藻是研究植物适应高盐胁迫的分子机制的重要的基因资源宝库。作为经典的耐盐模式生物，其耐盐机制至今仍然不是十分清楚。蛋白质的生成和降解是生物体内最基本也是最重要的新陈代谢过程,参与了生物体内几乎所有的重要生命活动。其中蛋白质的降解是真核生物生命周期中的一系列必不可少的过程，包括溶酶体途径和细胞质途径。溶酶体途径是一个非选择性的降解过程，发生在溶酶体中；而细胞质途径是一个选择性降解过程，发生在细胞质中。泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径(ubiquitin/26Sproteasomepathway)是细胞质途径中一种非常重要的机制。因其高效的降解细胞内蛋白的能力，参与了真核细胞调控的各个方面，包括细胞周期、胚胎发育、光形态建成、昼夜节律、植物激素信号、同源异形性、抗病和衰老等。在植物的响应胁迫和不同生长发育过程中也都扮演着重要角色。真核生物中，蛋白酶体的α亚基和β亚基都各含7种不同亚基。26S蛋白酶体是由1个20S核心颗粒(CP)和2个19S调节颗粒(RP)组成，是细胞内最常见的蛋白酶体形式。RP的沉降系数是19S，所以又称为19S调节亚基，至少含有19个蛋白成分，由基底(base)和盖子(lid)两个亚单位组成，分别与CP两端的α环相结合。lid含有9个蛋白成分，主要功能是在蛋白质底物降解前将泛素链从蛋白质底物上剪切掉以回收再次利用(去泛素化)。base由10个蛋白质成员构成，分别为Rpn1,Rpn2,Rpn10,Rpn13及RPT1,RPT2,RPT3,RPT4,RPT5,RPT6。主要功能是利用ATP水解提供能量，对切掉泛素链的蛋白质底物进行去折叠并转运至20S核心颗粒中进行降解。其中RPT1-6为AAA+蛋白超家族(ATPasesassociatedwithvariouscellularactivitiessuperfamily)成员，在结构上形成了一个六聚体的功能单位，按RPT1/RPT2/RPT6/RPT3/RPT4/RPT5的顺序排列。是水解ATP提供能量、蛋白质底物去折叠及转运的场所。在一些生物体中，RPT1可以与TBP蛋白（TATAboxBindingProtein）结合，对DNA的转录起调节作用，也可以正调控RNA聚合酶II转录得到的前体复合物进行组装[82]，还可以调控有丝分裂中后期的转换[83]。在果蝇中，RPT1参与了DNA损伤修复的细胞响应过程，并且在泛素依赖的蛋白酶体代谢蛋白的分解代谢中担任了不可或缺的角色[84,85]。目前还没有文献报到RPT1具有提高生物耐盐性的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种具有耐盐功能的基因DvRPT1，该基因是从绿色杜氏藻（Dunaliellaviridis）中分离出来的26S蛋白酶体调节亚基RPT1（RegulatoryParticleTriple-Aprotein1）基因，称为DvRPT1。本专利技术的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本专利技术目的之三是提供利用基因提高生物耐盐性方面的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有耐盐功能的基因DvRPT1，其特征在于该基因为SEQIDNO：1所示的DNA序列。一种上述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQIDNO2所示的氨基酸序列。一种载体，其特征在于该载体含有上述的具有耐盐功能的基因DvRPT1。一种酵母，其特征在于该酵母含有上述的载体。一种上述的具有耐盐功能的基因DvRPT1在提高生物体耐盐能力中的应用。一种上述的具有耐盐功能的基因DvRPT1在改良农作物性状中的应用。本专利技术通过逆境胁迫的方法，从绿色杜氏藻中克隆到了一个26S蛋白酶体调节亚基RPT1基因DvRPT1，并通过并通过转化酵母细胞和拟南芥，证明该基因还具有耐盐功能和改良农作物性状的应用价值。附图说明图1为本专利技术的DvRPT1基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于26S蛋白酶体调节亚基蛋白AAA家族的RPT1。图2为本专利技术的DvRPT1基因在酵母盐敏感突变体G19中的功能分析。即含DvRPT1完整ORF的EST序列插入到酵母表达载体pAJ401中，转化酵母盐敏感突变体G19，在含不同浓度的NaCl的表型展示培养基上进行表型测定。图3为本专利技术的绿色杜氏藻在不同NaCl处理下的总RNA电泳图。图4为本专利技术的DvRPT1基因在不同NaCl处理下的表达模式图。DvRPT1的表达受高盐胁迫的诱导。具体实施方法下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆（MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.）或酵母遗传学方法（MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,AdamsAetal编，ColdSpringHarborLaboratory,1998出版）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一：绿色杜氏藻DvRPT1全长编码区的克隆与分析对绿色杜氏藻D.viridis受不同浓度盐诱导的cDNA文库EST序列（表达序列标签）进行分析，发现了一个受盐诱导表达的序列（编号Contig6774），从中分离到了一个绿色杜氏藻26S蛋白酶体调节亚基RPT1基因，命名为DvRPT1。Contig6774序列全长1737bp，含有DvRPT1完整的开放阅读框（ORF）、真核翻译保守的Kozak序列（gccatgc）以及poly(A)结构（见序列表）。实施例二：绿色杜氏藻DvRPT1编码的蛋白结构、进化分析及定位预测VectorNTI软件的分析结果显示：该基因编码一个含433个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为48.3kDa，等电点为6.8。该编码蛋白属于26S蛋白酶体调节亚基RPT1蛋白家族。DvRPT1序列32-430AA为RPT1保守结构域。RPT1是26S蛋白酶体的调节亚基，位于26S蛋白酶体的base结构中，具有ATPase活性。DvRPT1序列178-345AA处为ATP结合蛋白保守结构域，可以结合ATP释放能量帮助泛素化标记的蛋白质去泛素化，从而进入蛋白酶体的base结构中实现蛋白降解。图1为本专利技术的Dv本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有耐盐功能的基因

【技术特征摘要】
1.一种具有耐盐功能的基因DvRPT1，其特征在于该基因为SEQIDNO：1所示的DNA序列。2.一种根据权利要求1所述的基因的编码蛋白，其特征在于该蛋白是SEQIDNO2所示的氨基酸序列。3.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的具有耐盐功...

【专利技术属性】
技术研发人员：李平，李艺廉，王雪薇，唐远平，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31