减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌制造技术

提供用于治疗或预防炎性病症的方法和组合物。本发明专利技术组合物包含经遗传修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。本发明专利技术方法包括给予受试者经修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。给予所述重组细菌促进所需的治疗反应。所述重组细菌可以以单独剂量或系列剂量给予。本发明专利技术方法在治疗或预防多种炎性病症包括，例如，治疗或预防炎性肠病、结肠炎或克罗恩病中得到应用。

Recombinant Lactobacillus capable of reducing inflammatory response with reduced lipid phosphate acid

Methods and compositions for the treatment or prevention of inflammatory diseases. The compositions of the invention comprise genetically modified bacteria to reduce the presence of recombinant acid bacteria on the cell surface. The method of the present invention includes modifying the recombinant bacteria that are shown on the surface of the cell to reduce the amount of lipid phosphate acid displayed on the cell surface. The recombinant bacteria are given to promote the desired therapeutic response. The recombinant bacteria can be given at a single dose or a series of doses. The method of the invention is applied in the treatment or prevention of various inflammatory diseases, including, for example, the treatment or prevention of inflammatory bowel disease, colitis or Crohn's disease.

【技术实现步骤摘要】
减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌本申请为分案申请，原申请的申请日为2011年6月16日，申请号为201180039874.2(PCT/US2011/040674)，专利技术名称为“减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌”。专利
本专利技术涉及用于减少炎症的方法和组合物。对作为文本文件通过EFS-WEB提交的序列表的引用序列表的正式副本作为文本文件通过EFS-Web与说明书一起提交，其遵从美国信息交换标准码(ASCII)，文件名称为406734seqlist.txt，创建日期为2011年6月16日，大小为15.7KB。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分，因此通过引用以其整体结合到本文中。专利技术背景肠道免疫稳态的维持涉及细菌微生物区系、肠上皮与宿主先天免疫细胞之间的平衡相互作用。这些免疫相互作用的失调可导致免疫功能障碍并引起明显的炎症，这是人炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病通常所具有的。尽管还未完全理解IBD的细胞和分子机制，但数据表明炎性细胞因子(例如IL-12)诱导的慢性肠炎症起关键作用。这些细胞因子启动对强烈牵涉疾病进展的致病性CD4+T细胞的分化。相应地，研究显示对这些细胞的调节减轻实验性结肠炎。此外，如IL-12、活化树突状细胞(DC)利用IL-12p40亚基分泌的IL-23也牵涉多种自身免疫疾病(包括IBD)的发展。IL-23的炎性性质已被归因于对Th17的诱导。此外，该细胞因子还激活DC中炎性细胞因子例如TNFα和IL-6的产生。合起来，研究显示阻断IL-12p40亚基信号转导显著减少炎症，并表明IL-12和IL-23二者参与导致IBD的炎性级联。与此二者细胞因子相反，IL-10对炎性信号发挥调节作用，从而调节炎性细胞因子引发的免疫反应。益生菌(probiotic)微生物可与宿主免疫细胞相互作用，并且特定益生菌乳杆菌种类可刺激DC产生炎性细胞因子(即IL-12)和调节性IL-10。乳杆菌是人胃肠道中的正常栖居者(inhabitant)，且为小肠中天然小型生物群的主要组分。认为这些细菌是有益的共生物，并且一些种类和菌株由于人类消费的历史悠久而被普遍认为是安全的。本领域需要进一步的方法和组合物以改进炎性胃肠病症例如IBD的治疗。专利技术简述提供用于减少受试者炎症的方法和组合物。所述组合物包含经遗传修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸(lipoteichoicacid)展示的重组细菌。方法包括给予受试者经修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。给予所述重组细菌促进所需的治疗反应。所述重组细菌可以以单剂量或系列剂量给予。方法在治疗或预防多种炎性病症包括，例如，治疗或预防炎性肠病、结肠炎或克罗恩病中得到应用。附图简述图1(A和B)显示LTA生物合成相关通路和基因。C-D显示使用剪接重叠延伸(SOEing)PCR扩增和连接的靶ORF内部区域侧翼的两个非邻接片段(Horton,RM(1995)MolBiotechnol.Apr;3(2):93-9)。将所得片段克隆到pORI28并转化到包含温度敏感型辅助质粒pTRK669的嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCK1392中。利用PCR，使用靶区域侧翼的引物，针对缺失突变对ERM敏感型细胞进行筛选，并通过对包含缺失的区域进行测序来确认。图2(A)显示用NCK56(也称为嗜酸乳杆菌NCFM)或NCK2025处理的DC的表型。将骨髓来源的DC与NCK56或NCK2025共培养24小时。细胞用相应的抗体染色，固定，随后用FACSCalibur分析。B部分显示单独培养或与NCK56或NCK20251:1培养1和6小时的DC。提取RNA、反转录并使用针对TLR1和TLR2的引物进行实时PCR。所显示数据表示单独的DC或这些细胞与NCK56或NCK2025的共培养物(1小时)。C部分显示细胞因子分析。通过ELISA测定NCK56或NCK2025处理以及未处理DC的上清液中释放的细胞因子。D部分显示T细胞增殖。连续四天用NCK56或NCK2025口服治疗多组C57BL/6小鼠(5/组)。取得肠系膜LN-T细胞，并与NCK56或NCK2025处理的以及未处理的DC共培养4天以使用[3H]胸苷掺入测定T细胞增殖。在一些实验中，为恢复抑制的T细胞增殖，将抗IL-10抗体加入来源于与NCK2025共培养的DC的上清液中。来源于各组小鼠的肠系膜LN-T细胞与用嗜酸乳杆菌菌株处理或未处理的DC共培养以测定细胞因子。图3显示NCK2025对DSS诱导的结肠炎的改善。A部分显示连续4天经口接种NCK56或NCK2025(5x108cfu/100µl/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(n=10)。将这些组的小鼠暴露于3%DSS(溶解在饮用水中)中5天，接着7天白水，并评估结肠炎随时间的进展，包括H&E染色、体重减轻、腹泻和潜血检测阳性(hemoccultpositivity)。B-E部分显示结肠H&N染色。B显示未处理的小鼠；C部分DSS处理的小鼠；D显示NCK56-DSS处理的小鼠；以及E显示NCK2025-DSS处理的小鼠。F表示结肠炎评分。FOB代表粪便潜血检测血液阳性(fecalhemoccultbloodpositivity)，DAI代表疾病活性指数。数据表示至少三个独立实验。G部分显示结肠细胞因子分析。NCK56或NCK2025或DSS处理的小鼠(5/组)的结肠用冷PBS清洗，切成碎片，37℃培养18h。使用ELISA测定细胞因子。图4显示NCK2025对已建立的结肠炎的减轻。A-D部分显示三组C57BL/6小鼠(10/组)，其首先接受五天周期的3%DSS(溶解在无菌水中)以引发结肠炎，其中的两组随后连续四天用NCK56或NCK2025口服治疗。监测疾病进展，直至实验方案的第13天(此时小鼠被处死)，评估结肠。B-D部分显示结肠H&N染色。B部分显示DSS处理的小鼠；C部分显示DSS-NCK56处理的小鼠；D部分显示DSS-NCK2025处理的小鼠。E部分表示结肠炎评分。FOB代表粪便潜血检测血液阳性，DAI代表疾病活性指数。数据表示至少三个独立实验。F部分显示结肠细胞因子分析。洗涤各组小鼠的结肠，切成碎片，37℃培养18h。通过ELISA测定细胞因子。图5显示NCK2025对Treg细胞的诱导。A-B部分显示连续4天经口接种NCK56或NCK2025(5x108cfu/100µl/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(5/组)。在第五天，将小鼠处死，清洗分离的结肠。自每组小鼠制备结肠单细胞悬浮液，并通过Percol梯度富集。淋巴细胞用相应的或同种型匹配抗体染色，并通过FACSCalibur分析。重复实验至少7次。图6显示IL-10-/-小鼠中结肠炎的诱导。A-B：C57BL/6IL-10-/-小鼠组(10/组)常规喂养1周。小鼠连续四天接种NCK56或NCK2025，然后喂食低剂量吡罗昔康(piroxicam)1周，随后喂食高剂量吡罗昔康1周以加速并诱导结肠炎的发病。测定体重减轻，两周后处死小鼠，制备结肠横断面瑞士卷(coloncross-sectionalSwissroll)和组织切片用于H&本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组或分离的细菌，其已经被遗传修饰以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。

【技术特征摘要】
2010.06.18 US 61/356165;2011.01.18 US 61/4335981.重组或分离的细菌，其已经被遗传修饰以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。2.权利要求1的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。3.权利要求1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQIDNO:1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。4.权利要求1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。5.前述权利要求中任一项的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌为益生菌细菌。6.权利要求5的重组或分离的细菌，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。7.权利要求6的重组或分离的细菌，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。8.权利要求7的重组细菌，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。9.权利要求8的重组或分离的细菌，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。10.权利要求8的重组或分离的细菌，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。11.制备重组或分离的细菌的方法，所述方法包括遗传修饰细菌以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。12.权利要求11的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。13.权利要求11或12的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述重组细菌为益生菌细菌。15.权利要求14的方法，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。16.权利要求15的方法，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。17.权利要求16的方法，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。18.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。19.权利要求17的方法，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述嗜酸乳杆菌已经被修饰以降低包含SEQIDNO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。21.减少受试者炎症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌。22.治疗或预防受试者胃肠道炎性病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌。23.权利要求21或22中任一项的方法，其中所述受试者为动物。24.权利要求23的方法，其中所述受试者为哺乳动物。25.权利要求24的方法，其中所述受试者为人。26.权利要求23的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：TR克莱恩哈默，E普菲勒，M莫哈马扎德，
申请(专利权)人：北卡罗莱纳州立大学，西北大学，
类型：发明
国别省市：美国,US