基于His标签的PNGaseF固定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于His标签的PNGase F固定方法，属于固定化酶领域，本发明专利技术将His标签的PNGase F与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP‑IDA/Ni)进行固定，将MNP‑IDA/N作为固定材料，不仅体积小、比表面积大，而且能够方便快捷地被磁分离，得到相对纯净的反应底物，且本发明专利技术对PNGase F的固定效率远远高于传统的物理方法，不易被普通缓冲液或反应液洗脱，而且不同于一般的非定向化学固定，不干扰酶活性。

PNGaseF fixing method based on His tag

The invention discloses a method based on fixed F His tag PNGase, belonging to the field of enzyme immobilization, the His label PNGase F and containing modified IDA/Ni magnetic nanoparticles (MNP IDA/Ni) were fixed, MNP IDA/N as fixed materials, not only has the advantages of small size, large surface area, and to conveniently by magnetic separation, obtain relatively pure substrate, and the invention of fixed F efficiency of PNGase is much higher than that of the traditional physical method, is not easy to be ordinary buffer or reaction liquid elution, and different from non directional chemical general fixed, does not interfere with enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
基于His标签的PNGaseF固定方法
本专利技术属于固定化酶领域，具体涉及一种基于His标签的PNGaseF固定方法。
技术介绍
N-糖酰胺酶(EC3.5.1.52,Peptide-N-GlycosidaseF,简称PNGaseF)能够专一性的识别连接的糖基化位点，并将糖链从糖蛋白的天冬酰胺位置水解。目前为止，PNGaseF因为生产条件所限，生产周期长，纯化步骤繁琐，所以产量偏低，价格高，且PNGaseF不能重复利用。近年，有研究者试图通过传统的固定化酶方法对PNGaseF进行固定，从而达到高效、可重复性地利用PNGaseF；常用的固定方法有物理方法：如吸附，包埋等，但固定后的酶容易被洗脱，所以用的不多；另外一种化学法是采用碳二亚胺或者戊二醛的方法非定向固定。也有报道证明PNGaseF已成功固定在碳纳米管、整体柱、纳米金刚石以及磁珠等固定材料上，然而这些固定都是PNGaseF的氨基与固定材料表面的羧基随机进行的反应，因为PNGaseF并不仅仅只有N-端有氨基，在蛋白质上还有很多氨基，这些氨基随机地与固定材料上的羧基耦联，使固定后的PNGaseF的活性将会大大受到影响。
技术实现思路
针对现有技术中固定化存在的缺点，我们采用了PNGaseF表达过程中使用的His标签进行酶的定向固定，这种方法的固定效率远远高于传统的物理方法，不易被缓冲液或反应液洗脱，而且不同于一般的非定向化学固定，不干扰酶活性。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种基于His标签的PNGaseF固定方法，该方法将His标签的PNGaseF与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)进行固定，具体包括如下步骤：(1)含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)使用耦联缓冲液清洗三次，所述的耦联缓冲液为：20mMTris,50mMNaCl,pH7.5。(2)步骤(1)的MNP-IDA/Ni中加入带有His标签的PNGaseF酶液，4℃，100rpm/min反应60min，所述MNP-IDA/Ni与PNGaseF酶的体积比为5:2；所述带有His标签的PNGaseF酶液的制备方法为：A、PNGaseF酶所属的E.coliDE3细胞培养于含有卡那霉素的LB培养基，当培养细胞浓度的OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，250rpm/min，37℃条件下诱导3小时；B、8000rpm/min离心10min，收集步骤A诱导表达的细胞，弃培养基上清，使用裂解缓冲液(20mMTris,50mMNaCl,5mMEDTA,5％Glycorel，pH7.5)重悬细胞沉淀；C、步骤B的重悬液置于冰上超声破碎20min，3s超声/3s间歇；D、以12000rpm/min离心10min，分离步骤C破碎后的细胞裂解液，弃上清；E、将步骤D的沉淀再次使用裂解缓冲液(20mMTris,50mMNaCl,5mMEDTA,5％Glycorel，pH7.5)重悬，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；F、重复步骤E三次；G、使用漂洗缓冲液(20mMTris,50mMNaCl,5mMEDTA,5％Glycorel，4MUrea，pH7.5)再次重悬并漂洗步骤F的沉淀，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；H、使用变性缓冲液(20mMTris,50mMNaCl,5mMEDTA,5％Glycorel，8MUrea，pH7.5)再次重悬步骤G的沉淀，并转移至摇床100rpm/min，37℃变性30min；I、12000rpm/min离心10min，分离步骤H变性后的溶液，上清转移至透析袋，透析至保存缓冲液(20mMTris,pH7.5)。(3)偶联固定后的MNP-IDA/Ni-PNGaseF置于磁场中分离，弃上清,然后加入耦联反应液重悬MNP-IDA/Ni-PNGaseF，清洗MNP-IDA/Ni-PNGaseF，磁分离，弃上清，使用耦联反应液清洗3次。优选地，使用如上方法固定的His标签的PNGaseF，其应用方法为：RNaseB变性后，加入相同量的MNP-IDA/Ni-PNGaseF(耦联反应液重悬)，然后将反应混合液置于微波的高火档位下，进行酶切实验，微波反应10s、1-9次或者在250rpm，37℃恒温摇床中反应4-10min。相对于现有技术，本专利技术具有的优点为：1、利用His标签固定的PNGaseF可以被多次重复使用，而且His标签与固定材料之间的耦联可以被咪唑等几种试剂洗脱，即使酶在多次使用过程中损失或活性降低，仍然可以使用重新使用固定材料固定新的PNGaseF。2、使用了磁性的纳米颗粒--含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)作为固定材料，这种磁性纳米颗粒在微波的辅助作用下，能快速升高局部反应温度，提高酶的反应效率，加快酶切速度，且实验反应中的微波不需要特定的专业微波发生器，只需要使用常见的家庭微波炉即可，这进一步普及了微波辅助酶切的应用。3、使用了磁性的纳米颗粒--含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒(MNP-IDA/Ni)作为固定材料，这种材料不仅体积小，比表面积大，而且能够方便快捷地被磁分离，从而得到相对纯净的反应底物。4、本专利技术对PNGaseF的固定效率远远高于传统的物理方法，不易被普通缓冲液或反应液洗脱，而且不同于一般的非定向化学固定，不干扰酶活性，试验结果证明磁性纳米颗粒固定的PNGaseF与非固定的PNGaseF具有一样的酶活性。附图说明图1为PNGaseF(1)和MNP-IDA/Ni-PNGaseF(2)的酶切活性比较，由图可知：PNGaseF(1)和MNP-IDA/Ni-PNGaseF(2)可以释放相同量的糖，RNaseB作为PNGaseF的标准酶切底物。图2为微波辅助PNGaseF酶切实验，Marker左边是微波辅助酶切结果，90s完全酶切RNaseB,右边第一条是RNaseB完全酶切的结果，第二条带是没有酶切的结果，第三到六条带是涡旋反应4min到10min的结果。具体实施方式以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案做进一步作描述，但是本专利技术的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本专利技术构思的改变或等同替代均包括在本专利技术的保护范围之内。实施例1(1)取1mL(约5mg/mL)固定相MNP-IDA/Ni置于离心管中，磁分离，弃上清；然后使用耦联反应液(20mMTris,50mMNaCl,pH7.5)重悬固定相，磁分离，弃上清，使用耦联缓冲液清洗三次；(2)步骤(1)的MNP-IDA/Ni中加入2mL(约1mg/mL)带有His标签的PNGaseF酶液，4℃，100rpm/min反应60min；所述带有His标签的PNGaseF酶液的制备方法为：A、PNGaseF酶所属的E.coliDE3细胞培养于含有卡那霉素的LB培养基，当培养细胞浓度的OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，250rpm/min，37℃条件下诱导3小时；B、8000rpm/min离心10min，收集步骤A诱导表达的细胞，弃培养基上清，使用裂解缓冲液(20mMTris,50mMNaCl,5mMEDTA,5％Glyco本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于His标签的PNGase F固定方法，其特征在于：该方法将His标签的PNGase F与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒进行固定，具体包括如下步骤：(1)固定相MNP‑IDA/Ni置于离心管中，磁分离，弃上清；然后加入耦联反应液重悬固定相，磁分离，弃上清，使用耦联缓冲液清洗三次；所述耦联反应液为20mM Tris、50mMNaCl、pH 7.5；(2)步骤(1)的MNP‑IDA/Ni中加入带有His标签的PNGase F酶液，4℃，100rpm/min反应60min，所述MNP‑IDA/Ni与PNGase F酶的体积比为5:2；(3)固定后的MNP‑IDA/Ni‑PNGase F置于磁场中分离，弃上清,然后加入耦联反应液重悬MNP‑IDA/Ni‑PNGase F，清洗MNP‑IDA/Ni‑PNGase F，磁分离，弃上清，使用耦联反应液清洗3次。

【技术特征摘要】
1.一种基于His标签的PNGaseF固定方法，其特征在于：该方法将His标签的PNGaseF与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒进行固定，具体包括如下步骤：(1)固定相MNP-IDA/Ni置于离心管中，磁分离，弃上清；然后加入耦联反应液重悬固定相，磁分离，弃上清，使用耦联缓冲液清洗三次；所述耦联反应液为20mMTris、50mMNaCl、pH7.5；(2)步骤(1)的MNP-IDA/Ni中加入带有His标签的PNGaseF酶液，4℃，100rpm/min反应60min，所述MNP-IDA/Ni与PNGaseF酶的体积比为5:2；(3)固定后的MNP-IDA/Ni-PNGaseF置于磁场中分离，弃上清,然后加入耦联反应液重悬MNP-IDA/Ni-PNGaseF，清洗MNP-IDA/Ni-PNGaseF，磁分离，弃上清，使用耦联反应液清洗3次。2.如权利要求1所述的一种基于His标签的PNGaseF固定方法，其特征在于：步骤(2)中所述带有His标签的PNGaseF酶液的制备方法为：A、PNGaseF酶所属的E.coliDE3细胞培养于含有卡那霉素的LB培养基，当培养细胞浓度的OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，250rpm/min，37℃条件下诱导3小时；B、8000rpm/min离心10min，收集步骤A诱导表达的细胞，弃培养基上清，使用裂解缓冲液重悬细胞沉淀；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘欣，张亮，王畅，吴亦可，刘胜，
申请(专利权)人：华中科技大学鄂州工业技术研究院，华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42