一种检测过氧化氢活性的荧光探针及制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一种检测过氧化氢活性的荧光探针，通过将阿司匹林溶解在二氯甲烷中，加入1‑羟基苯并三唑、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，再加入含有羟基的荧光团，经萃取减压旋干、柱层析获得。本发明专利技术提供的荧光探针的检测方法简便，检测体系中加入探针孵育10分钟测荧光强度，即可给出结果，无需其它试剂辅助；能实现活细胞级组织中过氧化氢活性的检测；在对过氧化氢进行检测的同时，能够对氧化应激损伤起到一定的保护性作用。本发明专利技术的荧光探针可在检测溶液中过氧化氢浓度中的应用，也可在检测细胞或组织中过氧化氢活性中的应用以及在检测活细胞中对氧化应激损伤的保护作用的应用。所述荧光探针的结构式：

A fluorescent probe for detection of hydrogen peroxide activity and its preparation and Application

The invention provides a fluorescent probe for detecting hydrogen peroxide activity, through the use of aspirin dissolved in dichloromethane, adding 1 hydroxyl benzene and three triazole, 1 ethyl (3 two methyl amino propyl) two carbonyl imine hydrochloride, adding fluorophore containing hydroxyl, obtained by extraction, decompression rotary dry column chromatography. Detection method of fluorescent probe provided by the invention is simple, with the detection system probe was incubated for 10 min measured fluorescence intensity, then the results are given, without other auxiliary reagents; detection of hydrogen peroxide activity of live cells in the organization; detection of hydrogen peroxide to protective effect on oxidative stress injury. Application of fluorescent probes of the invention can be used in the detection of hydrogen peroxide concentration in the solution, can also be applied in the detection of hydrogen peroxide in cells or tissue activity in living cells as well as in the application of detection of protective effect on oxidative stress injury. The structure of the fluorescent probe is described:

【技术实现步骤摘要】
一种检测过氧化氢活性的荧光探针及制备和应用
本专利技术属生物检测领域，涉及一类检测过氧化氢活性的荧光探针，及其制备方法和在检测生物样本中过氧化氢活性中的应用。
技术介绍
内皮细胞功能紊乱对心脑血管疾病的发生发展起着重要的促进作用。虽然二者之间的潜在的分子事件仍未有明确的定论，但是，在病理进程中必然伴随着氧化应激的发生。因此，在神经血管及心血管疾病的发生发展中，活性氧自由基(ROS)起着关键的作用。过氧化氢是活性氧自由基家族中的关键成员，在包括中风等重大疾病的病理机制中均有参与。内皮细胞中的过氧化氢水平的失衡，会导致细胞内氧化还原紊乱，破坏内皮细胞正常功能的发挥，对细胞造成损伤。作为促氧化分子，过氧化氢主要由超氧化物自发或是以超氧化物歧化生成。过氧化氢可被谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶、硫氧化还原蛋白或过氧化还原酶(Prx)等酶清除。过氧化氢可以氧化一些生物大分子，如脂质、蛋白质和DNA，从而引起细胞毒性损伤。有研究报道表明过氧化氢不仅限于表现损伤的一方面，过氧化氢还可以作为第二信使，在生理过程中起着重要的调控作用。因此，过氧化氢表现作用的好坏主要取决于其产生的部位、局部浓度及累积情况。对活体组织中过氧化氢水平进行检测具有重要的疾病诊断意义。针对过氧化氢的检测，现已有多种方式，包括氧化还原敏感荧光蛋白、纳米管、超极化、超声、质谱、PET、化学发光，以及过氧化氢反应性小分子荧光探针。值得注意的是，小分子荧光探针由于具有高敏感、对组织无损伤等特性，越来越引起研究人员的关注。然而，现有的市售的荧光探针，如二氯二氟荧光素、二氢罗丹明等，对ROS缺乏特异性。为解决这个问题，Chang实验室率先使用能与过氧化氢进行生物相容性反应生成酚类的芳基硼酸酯类探针。这一方法为过氧化氢的生物学研究提供了重要的方法，然而，芳基硼酸酯类探针对过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)的反应活性高于过氧化氢，在生物体内脱靶反应严重，这一缺点限制了其广泛应用。同时，该类探针反应后的副产物硼酸的生物学效应未知。因此，我们对其结构进行设计改造。设计合成了对过氧化氢具有高度特异性的新型探针，同时，其反应后的产物可以对过氧化氢造成的氧化应激损伤起到一定的保护性效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测过氧化氢活性的荧光探针，是一种能快速在体外和体内检测过氧化氢活性、并对细胞氧化应激损伤起到明显保护作用的荧光探针。具有式I所示的结构：R为荧光团如苯并噻唑类、香豆素、荧光素、1,8-萘二酰亚胺类、萘系列染料、罗丹明、花菁素系列、TCF(2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃)、NBD(7-硝基-苯并-2-氧杂-1,3-二唑)染料、苯并吡喃类染料、2,5-二苯基恶唑类、染料氟硼二吡咯(BODIPY)等。本专利技术的另一个目的是提供式I所示的化合物的制备方法，通过以下制备方法实现：将阿司匹林溶解在二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，再加入含有羟基的荧光团，室温反应，经萃取，减压旋干溶剂，柱层析，即可得式I化合物。本专利技术的再一个目的是提供式I所示的化合物在检测溶液中过氧化氢浓度中的应用，通过以下步骤实现：将探针分子用少量二甲基亚砜溶解，制备储备液；取少量储备液，加入待检测体系中，使探针终浓度为10微摩尔，室温孵育，一小时后在荧光光谱仪上测定体系荧光强度，进而确定待检测溶液中的过氧化氢浓度。本专利技术的又一个目的是提供式I所示的化合物在检测细胞或组织中过氧化氢活性中的应用，通过以下步骤实现：(1)细胞中外源过氧化氢浓度的检测：体外培养EA.hy926细胞，接种于玻璃片上，待细胞密度达到70-80％后用于后续实验。细胞分别孵育5μM,10μM,20μM的探针观测探针的有效工作浓度；给予50μM,100μM,200μM,的过氧化氢处理，检测探针最低检测限；(2)细胞中内源过氧化氢浓度的检测：体外培养EA.hy926细胞，接种于玻璃片上，待细胞密度达到70-80％后用于后续实验。提前15分钟孵育探针，用无糖HBSS替换细胞培养液，并置于密封罐中，对细胞进行不同时间的缺糖缺氧应激损伤(OGD)处理。通过共聚焦对探针的荧光进行成像，观察不同OGD时间下探针的响应性；(3)小鼠大脑中脑动脉闭塞(MCAO，MiddleCerebralArteryOcclusion)损伤后探针的响应性：小鼠给予MCAO模型处理，24小时后给予3％水合氯醛，取脑。在脑脊液、充氧条件下对脑组织进行切片处理，200微米厚度。切片后，在34摄氏度水浴条件下，放在脑脊液中孵育探针15分钟，利用NikonA1R共聚焦显微镜对脑片拼图，观测全脑中探针的荧光。本专利技术的第五个目的是提供式I所示化合物在检测活细胞中对氧化应激损伤的保护作用的应用。通过以下步骤实现：体外培养EA.hy926细胞，接种于六孔板中，待细胞密度达到70-80％后用于后续实验，给予细胞200μM过氧化氢，分别处理不同时间，观察细胞凋亡率，并选取合适时间进行后续实验；实验设组如下：对照组、过氧化氢处理组、孵育探针组、提前孵育探针并给予过氧化氢处理组；对上述分组细胞利用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡，对探针的保护性作用进行评估。本专利技术提供的荧光探针本身在水溶液中无荧光，但可与双氧水发生特异性反应，生成具有强荧光的产物，同时释放出具有抗氧化效果的阿司匹林，从而实现双氧水的特异灵敏性检测。本专利技术提供的荧光探针及检测方法具有以下有益效果：(1)检测方法简便，检测体系中加入探针孵育10分钟测荧光强度，即可给出结果，无需其它试剂辅助；(2)能实现活细胞级组织中过氧化氢活性的检测；(3)在对过氧化氢进行检测的同时，能够对氧化应激损伤起到一定的保护性作用。附图说明图1是探针分子Ia与过氧化氢反应前后变化。图2是探针分子Ib与过氧化氢反应前后变化。图3是探针分子Ic与过氧化氢反应前后变化。图4是探针分子Id与过氧化氢反应前后变化。图5是探针分子Ie与过氧化氢反应前后变化。图6是给予不同浓度过氧化氢，探针的荧光强度逐渐增强。图7是随OGD时间延长，探针荧光强度增强。图8是MCAO损伤后，孵育探针后显示荧光。图9是探针对过氧化氢造成的细胞凋亡有保护性作用。具体实施方式下面的实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是限制本专利技术的范围。实施例1：探针分子式Ia的合成将原料阿司匹林(386mg，2.14毫摩尔)溶解在20毫升二氯甲烷中，冰浴下加入HOBT(261mg，1.93毫摩尔)，EDC盐酸盐(370mg，1.93毫摩尔)，室温搅拌20分钟，加入2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-氟苯酚(262mg，1.07毫摩尔)，DIPEA(44μL,2.68毫摩尔)，室温搅拌，TLC检测原料反应完毕，加水淬灭，二氯甲烷萃取，再用饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋干过柱。得探针Ia，产率为36.7％。1HNMR(500MHz,CDCl3,δ):8.43(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),8.15(dd,J＝9.2,2.9Hz,1H),7.99(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(d,J＝8.0Hz,1H),7.73(td,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.48(t本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测过氧化氢活性的荧光探针，其特征在于，具有式I所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一种检测过氧化氢活性的荧光探针，其特征在于，具有式I所示的结构：R为荧光团如苯并噻唑类、香豆素、荧光素、1,8-萘二酰亚胺类、萘系列染料、罗丹明、花菁素系列、2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃染料、7-硝基-苯并-2-氧杂-1,3-二唑染料、苯并吡喃类染料、2,5-二苯基恶唑类、染料氟硼二吡咯。2.权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将阿司匹林溶解在二氯甲烷中，加入1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，之后再加入含有羟基的荧光团，室温反应，经萃取，减压旋干溶剂，柱层析，即得式I化合物。3.根据权利要求1所述的式I化合物在检测溶液中过氧化氢浓度中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：将探针分子用二甲基亚砜溶解，制备储备液；取储备液，加入待检测体系中，使探针终浓度为10微摩尔，室温孵育，一小时后在荧光光谱仪上测定体系荧光强度，进而确定待检测溶液中的过氧化氢浓度。4.根据权利要求1所述的式I化合物在检测细胞或组织中过氧化氢活性中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)细胞中外源过氧化氢浓度的检测：体外培养EA.hy926细胞，接种于玻璃片上，待细胞密度达到70-80％后用于后续实验，细胞分别孵育5μM,10μM,20μM的探针观测探针的有效工作浓度；给予50μM,100μM,200μM,的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新，王成坤，程娟，韩峰，卢应梅，胡永洲，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33