一种用于检测花生过敏原Ara h6基因的LAMP引物组合物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测花生过敏原Ara h6基因的LAMP引物组合物、检测试剂盒及检测方法。检测引物组包含SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示序列。该检测试剂盒包括LAMP工作液、荧光指示剂和/或显色剂、Bst DNA聚合酶、LAMP引物组合物、阳性对照和阴性对照。该检测方法为用CTAB法提取待检测样品的DNA，再将样品DNA加入到反应体系里，在60～65℃的一个等温条件下扩增45～90min，用荧光检测仪检测扩增结果的荧光曲线，和/或直接观察加有显色剂的反应管里的颜色变化，以判断样品里是否含有花生过敏原。本发明专利技术快捷迅速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测。

LAMP primer composition for detecting peanut allergen Ara H6 gene and its kit

The invention discloses a method for the detection of peanut allergen Ara H6 gene LAMP primer composition, detection kit and detection method. Primer group includes SEQ ID NO:1 ~ SEQ ID NO:4 shown in sequence. Including the LAMP kit solution, fluorescence indicator and / or chromogenic agent, Bst DNA polymerase, LAMP primer composition, positive control and negative control. The detection method for the extraction of the sample to be detected by DNA CTAB method, then the samples adding DNA to the reaction system, in a 60 ~ 65 DEG C under isothermal conditions was 45 ~ 90min, fluorescence curve amplification results by fluorescence detection, and / or directly observed with color reagent reaction in the change, to determine whether it contains samples of peanut allergen. The method is rapid, simple, specific and sensitive, and is suitable for real-time on-site detection.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测花生过敏原Arah6基因的LAMP引物组合物及其试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种用于检测花生过敏原Arah6基因的LAMP引物组合物、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
食物过敏是机体免疫系统对某些食物产生的异常免疫反应，相应的免疫球蛋白会和这些食物结合，释放出很多化学物质，引起过敏症状(如恶心、呕吐、湿疹等)，严重者会导致过敏性休克发生。世界粮农组织1995年报告，90％以上的食物过敏是由花生、大豆、牛奶、鸡蛋、鱼、贝类产品、坚果类等引起。据报道，花生是重要的食物过敏原，占食物过敏的10％～47％，其可引起过敏性肠炎、过敏性胃炎等过敏性疾病，严重的甚至会发生过敏休克和过敏性死亡。美国和欧盟等都要求在相应的商品上标明是否含有花生，以避免过敏患者误食而引起症状。因此对于商品是否含有花生过敏原的抽检，找到一种快速、简单的检测方法显得尤为重要。花生(peanut)在我国产量丰富、食用广泛，是我国上世纪90年代食物结构改革与发展纲要中提出的重点开发利用植物蛋白之一。但随着食用量的增加，引起过敏发病的几率不断上升。目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有Arah1、Arah2、Arah3、Arah4、Arah5、Arah6、Arah7、Arah8、Arah9、Arah10、Arah11等11种。Arah6是花生中的过敏原之一，属于2S白蛋白家族。Arah2和Arah6同为2S清蛋白家族成员，两者的氨基酸序列有59％相似，尤其是中间部分和C末端的蛋白序列更为相似。近年来，研究花生过敏原Arah6蛋白在过敏反应中的作用显得尤为重要。不言而喻，对检测食品中是否含有花生过敏原具有十分重要的意义。目前，检测花生过敏原主要有以下两种检测方法：1)检测花生过敏原蛋白成分，如酶联免疫吸附法(ELISA)、质谱法(MALDI—TOF/MS)、Westernblotting检测等方法；2)检测过敏原基因残留，如PCR检测技术，焦磷酸测序技术等，其中PCR检测方法是最主要、最准确的方法，但这类方法操作过程比较复杂，需要专业人员；所使用的仪器比较昂贵，检测也很耗时。另外电泳常用的EB染料为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。因此，找到一种快速、简单、安全的检测花生过敏原的检测方法显得极为必要。环介导等温基因扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification，以下简称LAMP法)是由Notomi等建立的一种快速高效、特异性强的核酸等温扩增技术，其具有快速简单、操作方便、灵敏度高、容易普及、安全可靠等优点，目前该技术尚未使用于检测花生过敏原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测花生过敏原Arah6基因的LAMP引物组合物，并提供一种含有上述LAMP引物组合物的检测试剂盒及使用该LAMP引物组合物的检测方法，本专利技术所述的检测方法具有特异性强、响应速度快、灵敏度高、结果判定简单、操作简便、价格低廉、应用范围广等特点。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测花生过敏原Arah6基因的LAMP引物组合物，其包括两条外引物(F3、B3)和两条内引(FIP、BIP)，这4条引物的核苷酸序列如下所示：正向外引物F3(SEQIDNo：1)：ATCTTCATTGATCATATAGCACA；反向外引物B3(SEQIDNo：2)：GGCTTAGTATGTGAGGTACG；正向内引物FIP(SEQIDNo：3)：ATGCAAATACTCCAAGATTCCCATTTAATTACTACAGCAAAGCCTGA；反向内引物BIP(SEQIDNo：4)：GCATGAAAATGTAACGTGGAAGCTAAAGGGAATGGAGGGTGG。本专利技术的第二个目的是提供一种含有上述LAMP引物组合物的用于检测花生过敏原Arah6基因的试剂盒。为了进一步优化上述试剂盒，本专利技术所采取的技术措施还包括：优选地，该试剂盒还包括LAMP工作液、荧光指示剂和BstDNA聚合酶。优选地，所述LAMP工作液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。优选地，所述荧光指示剂选自SYBRGreen、EverGreen、PicoGreen、SYTO系列中的至少一种；更优选为SYBRGreen，更具体的说为SYBRgreenⅠ。优选地，该试剂盒还包括显色剂。优选地，所述显色剂选自HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞和百里酚蓝；更优选为中性红(NeuRed染料)。优选地，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有花生过敏原基因的样品稀释液，所述阴性对照为不含花生过敏原基因的去离子水。优选地，该试剂盒的检测限为0.4ng/μL。在本专利技术一实施例中，一种用于检测花生过敏原Arah6基因的试剂盒包含以下组分：1)LAMP工作液：20mMTris-HCl(pH8.8，25℃)，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，8mMMgSO4，0.1％Tween-20；2)荧光指示剂：SYBRgreenⅠ；3)引物液：SEQIDNO：1～SEQIDNO：4所示的引物，4条引物浓度都为100μM；4)BstDNA聚合酶：浓度为8U/μL；5)显色剂：NeuRed染料(500uM)；6)对照：阳性对照为含有花生过敏原基因的样品稀释液，阴性对照为不含花生过敏原基因的去离子水。本专利技术的第三个目的是提供一种非诊断和治疗目的的用于检测花生过敏原Arah6基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1)采用CTAB法提取纯化待测样品的DNA；步骤2)用上述LAMP引物组合物进行环介导等温扩增反应；步骤3)结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，和/或根据反应体系是否出现颜色变化判断扩增结果。优选地，所述步骤2)的具体操作过程如下：在PCR八联管中配制反应混合体系：LAMP工作液16.7μL，引物液1.3μL，BstDNA酶1μL，显色剂NeuRed染料1μL，样品DNA5μL，用含有花生过敏原Arah6基因替代待检DNA设置阳性对照，用不含花生过敏原基因的去离子水替代待检DNA作为阴性对照。将配制好的体系均匀并离心，使PCR八联管中没有气泡为止，于60～65℃反应45～90min，同时采集荧光信号，并在95℃保持5min，最后降到室温25℃即可；更优选地，所述环介导等温扩增反应的反应条件为63℃60min。优选地，上述步骤2)可采用荧光指示剂SYBRgreenⅠ替换显色剂NeuRed染料，也可同时加入荧光指示剂SYBRgreenⅠ和显色剂NeuRed染料。可理解的是，在满足恒温扩增反应的条件下，上述反应混合体系中各试剂的浓度及用量均可进行适当的调整，但采用上述体积及浓度的试剂，其扩增效果最佳，检测结果更为准确。本专利技术基于环介导等温扩增技术(LAMP法)，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个特异的区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果生成含有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNA聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测花生过敏原Ara h6基因的LAMP引物组合物，其特征在于，包括如SEQ ID NO：1所示序列的正向外引物F3，如SEQ ID NO：2所示序列的反向外引物B3，如SEQ ID NO：3所示序列的正向内引物FIP以及如SEQ ID NO：4所示序列的反向内引物BIP。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测花生过敏原Arah6基因的LAMP引物组合物，其特征在于，包括如SEQIDNO：1所示序列的正向外引物F3，如SEQIDNO：2所示序列的反向外引物B3，如SEQIDNO：3所示序列的正向内引物FIP以及如SEQIDNO：4所示序列的反向内引物BIP。2.一种用于检测花生过敏原Arah6基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的LAMP引物组合物。3.根据权利要求2所述的一种用于检测花生过敏原Arah6基因试剂盒，其特征在于，还包括LAMP工作液、荧光指示剂和BstDNA聚合酶。4.根据权利要求2所述的一种用于检测花生过敏原Arah6基因试剂盒，其特征在于，所述LAMP工作液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20。5.根据权利要求3所述的一种用于检测花生过敏原Arah6基因试剂盒，其特征在于，所述荧光指示剂选自SYBRGreen、EverGreen、PicoGreen、SYTO系列中的至少一种。6.根据权利要求2所述的一种用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁旦，陈沁，方雪恩，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速创诊断产品有限公司，复旦大学，上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31