用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒，其中，该LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；当模板存在时，该LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，该LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下，剪切探针部分，从而发光。本发明专利技术的LSP引物检测的特异性好，灵敏度高，相近基因型间互不干扰，检测结果具有更高的荧光信噪比。

For LSP primer and kit for detection of human BRCA1 gene mutation

The invention discloses a method for detecting LSP primer and kit, human BRCA1 gene mutation in the LSP primer 5 'end of a section with different double fluorescent labeled linear probe, 3' end as a template and complementary sequence between two sequences with Spacer18 connection; when the template exists when the LSP can be extended with the template primer annealing, template for the synthesis of the complementary strand; when the template synthesis of the complementary strand after the LSP primer 5 'end of the probe part will combine with the formation of a scorpion like shape; along the downstream primer template complementary 3' end chain extension in the polymerase under the action of shear probe, and luminescence. The LSP primer has the advantages of good specificity, high sensitivity, no interference between the similar genotypes, and the detection result has higher fluorescence signal-to-noise ratio.

【技术实现步骤摘要】
用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒。
技术介绍
乳腺癌易感基因1(breastcancersusceptibllitygene1，BRCA1)是一种肿瘤抑癌基因，该基因位于17q12-21区，基因组长约80Kb，编码区5711bp，共24个外显子，编码一个具有1863个氨基酸残基的蛋白质。BRCA1蛋白具有N-端锌指结构域、BRCA1C末端基序(BRCT)、Rad51结合区、核定位区和转录活性区等5个特征性结构域。BRCA1蛋白参与DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节、中心体复制的负性调节、对肿瘤生长起负性调节作用、在维持基因组稳定性中起重要作用。若BRCA1基因发生突变，导致损伤的双链DNA不能得到修复，引起P53水平升高，继而P21升高，导致细胞凋亡和细胞周期停滞。如果是P53的基因修复失败，细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生。BRCA1基因可发生多形式、多位点基因突变，主要有移码突变、错义突变、无义突变。研究表明，BRCA1基因突变会导致家族遗传性乳腺癌及卵巢癌，带有BRCA1基因突变的患者一生中罹患乳腺癌的几率为40％-87％，卵巢癌的几率为16％-60％，除此之外也容易患其他癌症。通过检测BRCA1基因突变，能够凭借乳腺癌患病风险及采取预防措施，降低乳腺癌或卵巢癌的发病率。目前用于BRCA1突变检测方法的金标准为测序法技术。测序法是基因突变检测的可靠方法，也是应用最多的方法。其需要对样品进行扩增、纯化、序列分析，所需的时间长，成本高，对取材和技术的要求都比较高，最重要的是限制灵敏度不高，只能对含量大于30％的突变基因进行检测，对环境和操作者有危害，因此在临床应用上具有一定的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，所述LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；当模板存在时，所述LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，所述LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下剪切探针部分，从而发光。进一步的，所述BRCA1基因的引物序列如SEQIDNO:1-42所示，其中一对上游引物序列为荧光基团-SEQIDNO:1-淬灭基团-Spacer18-SEQIDNO:2，相应下游引物为SEQIDNO:3，上游引物序列为荧光基团-SEQIDNO:4-淬灭基团-Spacer18-SEQIDNO:5，相应下游引物为SEQIDNO:6，以此类推至上游引物序列为荧光基团-SEQIDNO:40-淬灭基团-Spacer18-SEQIDNO:41，相应下游引物为SEQIDNO:42。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有上述的LSP引物，用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒。进一步的，所述用于检测人类BRCA1基因突变的试剂盒，还含有BRCA1基因反应缓冲液1，BRCA1基因反应缓冲液2，BRCA1基因反应缓冲液3，BRCA1基因反应缓冲液4，BRCA1基因外控反应缓冲液，BRCA1基因阴性对照，BRCA1基因阳性对照。本专利技术的技术为线型蝎子引物(LinearScorpionPrimer，LSP)，该方法具有特异性强、灵敏度高的特点，同时拥有同一个反应管中通过不同荧光通道进行区分不同突变型的特点。该LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补序列，两段序列之间用Spacer18进行连接。当模板存在时，LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；接下来下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下，剪切探针部分，从而发光。本专利技术的试剂盒包含：上述LSP引物，BRCA1基因反应缓冲液1，BRCA1基因反应缓冲液2，BRCA1基因反应缓冲液3，BRCA1基因反应缓冲液4，BRCA1基因外控反应缓冲液，BRCA1基因阴性对照，BRCA1基因阳性对照。其中，BRCA1反应缓冲液1—BRCA1反应缓冲液4都包含200nmol/L突变型引物，200nmol/L人基因组内标(DNA)引物(即为表1中的BRCA1内参对应的上下游引物)，3.2mmol/LHCl、16.8mmol/LBase、60mmol/LKCl、2.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA·2Na、200μmmol/LdATP、200μmmol/LdGTP、200μmmol/LdCTP、200μmmol/LdUTP、100μmmol/LdTTP。BRCA1反应缓冲液1的突变引物是S4P、A7C、G10L突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液2的突变引物是M18T、C24A、H1732del突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液3的突变引物是G1731dup、G1735L、G1738G突变类型的引物(表1中对应的序列)；BRCA1反应缓冲液4的突变引物是A1739G、H1746A、L1750A突变类型的引物(表1中对应的序列)。BRCA1外控反应缓冲液包含200nmol/LBRCA1外控引物(即表1中BRCA1外控的上下游引物)，3.2mmol/LHCl、16.8mmol/LBase、60mmol/LKCl、2.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA·2Na、200μmmol/LdATP、200μmmol/LdGTP、200μmmol/LdCTP、200μmmol/LdUTP、100μmmol/LdTTP。BRCA1阴性对照为生理盐水。BRCA1阳性对照由S4P、A7C、G10L、M18T、C24A、H1732del、G1731dup、G1735L、G1738G、A1739G、H1746A、L1750A的12种突变型质粒与人基因组DNA按1:1体积比混合而来。DNA酶混合液：2.0U/0.5μL的Taq聚合酶，0.002U/0.5μL的UNG酶，酶储存缓冲液补足至0.5uL。酶储存缓冲液配置方法：加入0.5mol/LEDTA·2Na20μL，25体积％的TritonX-1004mL，5mol/LNaCl2mL，0.5mol/LHCl5.6mL，0.5mol/LBase4.4mL，加入30mL双重蒸馏水，50mL甘油，充分混合均匀后，补加双重蒸馏水定容至100mL。BRCA1反应缓冲液1能够检测S4P、A7C、G10L突变类型；BRCA1反应缓冲液2能够检测M18T、C24A、H1732del突变类型；BRCA1反应缓冲液3能够检测G1731dup、G1735L、G1738G突变类型；BRCA1反应缓冲液4能够检测A1739G、H1746A、L1750A突变类型；BRCA1外控反应缓冲液作为判断结果用。在8联PCR反应条的每个反应管中加入25μL石蜡油，备用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，其特征在于，所述LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；当模板存在时，所述LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，所述LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下剪切探针部分，从而发光。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，其特征在于，所述LSP引物的5’端为一段带有不同双荧光标记的线型探针，3’端为一段与模板互补的序列，两段序列之间用Spacer18进行连接；当模板存在时，所述LSP引物便能与模板退火延伸，合成模板互补链；当模板互补链合成完后，所述LSP引物的5’端探针部分就会与之结合，形成一个类似蝎子的形状；下游引物则沿着模板互补链的3’端进行延伸，在聚合酶的作用下剪切探针部分，从而发光。2.根据权利要求1所述的用于检测人类BRCA1基因突变的LSP引物，其特征在于，所述BRCA1基因的引物序列如SEQIDNO:1-42所示，其中一对上游引物序列为荧光基团-SEQIDNO:1-淬灭基团-Spacer18-SEQIDNO:2，相...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷彩霞，魏劭，魏超，
申请(专利权)人：厦门安普利生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35