一种快速评估睾丸生精功能的免疫荧光染色法及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于快速评估睾丸生精功能情况的抗体组合、方法及检测试剂盒，所述抗体组合包括：(1)由FITC荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及PE荧光标记的鼠抗人源c‑KIT抗体；(2)由FITC荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及PE荧光标记的鼠抗人源PNA抗体。以睾丸生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c‑KIT、SCP3和PNA表达情况判断各级生精细胞是否存在，从而评估患者的生精功能。本发明专利技术首次在术中/术后将生殖细胞表面标志物的免疫荧光化学染色用于快速评价患者的生精功能，检测速度快，具有极高的敏感度和可靠的特异度，并且能将各阶段的生精细胞区分开来，对于患者的评估和后续治疗有着重要的价值。

An immunofluorescence staining method and kit for rapid evaluation of testicular spermatogenic function

The present invention provides a method for rapid assessment of antibody combination, spermatogenic function method and detection kit, the antibody combination includes: (1) by FITC fluorescence labeled Rabbit anti human GFRA1 antibody and PE labeled mouse anti human C antibody KIT; (2) marked by FITC the fluorescent Rabbit anti human SCP3 antibody and PE labeled mouse anti human PNA antibody. In the seminiferous tubule as test samples by immunohistochemical staining for detection of GFRA1, KIT, C samples SCP3 and PNA expression of spermatogenic cells to determine whether there is, in order to assess patients with spermatogenic function. The invention for the first time in the intraoperative / postoperative reproductive cell surface marker for rapid evaluation of spermatogenic function in patients with immunofluorescence dyeing, fast detection speed, high sensitivity and reliable specificity, and can be in various stages of the spermatogenic cells differentiate, has important value for patients evaluation and follow-up.

【技术实现步骤摘要】
一种快速评估睾丸生精功能的免疫荧光染色法及其试剂盒
本专利技术涉及生殖医学
，具体地说，是一种用于快速、准确评估睾丸组织生精功能情况的抗体组合、染色方法及其试剂盒。
技术介绍
非梗阻性无精子症(Non-obstructiveazoospermia，NOA)在不育男性中的发病率约10％，占到无精子症的60％，其特征表现为睾丸组织不同程度的生精损害。非梗阻性无精子症病人的睾丸组织的病理分类主要分为：1.生精低下；2.生精阻滞；3.唯支持细胞综合征；等。目前，手术中(包括睾丸穿刺、睾丸活检和睾丸显微取精术)判断病人睾丸生精情况的方法主要是：将睾丸组织在HTF液(一种人输卵管液模拟物)中尽量剪碎成单个细胞或细胞团块后，将细胞悬液制成玻片放置在带相差的正置显微镜下直接观察，寻找是否有精子及各级生精细胞。这种方法虽然比较简单快速，但是破坏了生精小管的正常结构，因为操作人员是根据各级生精细胞的大小、折光度和核质比等指标进行辨认区分，所以检测结果的准确性很大程度上依赖于检验人员的经验水平，对于术中及术后患者的评估和治疗具有一定的局限性。现阶段临床上使用的另一种评估患者生精功能的方法，也是现行公认的“金标准”是患者睾丸组织的术后石蜡切片的HE染色，但这种方法所需要的准备时间长，患者和医务人员通常需要两周时间才能知道检查结果，对于患者的术中评估以及术后治疗方案的选择不具有即时性。另外，睾丸生精小管是长形的管道结构，管腔内的生精灶并不是均匀分布的，特别是对于生精受损的病人而言，常常会在睾丸整体生精功能下降甚至丧失的情况下仍然保留小范围的局灶性的生精灶，而病理切片是管腔的横断面，所以病理切片能观察到生精灶的概率等于生精灶占整个生精小管长度的比例，当病人生精情况较差，这一比例较小时，病理切片的横断面很容易避开生精灶而导致假阴性的结论。另一方面，对于在手术中将睾丸组织剪碎成单个细胞或细胞团块后放置在带相差的正置显微镜下直接观察的方法，当生精灶占整体生精小管的比例较小时，也可能由于生精细胞被过度稀释导致假阴性的结论。因此根据现有技术的缺点，有必要研发一种用于评估患者睾丸生精功能情况的方法，可以在术中快速有效查找和区分患者睾丸生精小管内的生殖细胞。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针对现有技术中耗时长或主观性强等不足，提供一种快速、准确评估睾丸组织生精功能的方法。本专利技术的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的荧光染色试剂盒。本专利技术的第三个目的是针对现有技术中的不足，结合睾丸各种生精细胞的特异性标志物相关规律，提供一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合。本专利技术的第四个目的是针对现有技术中结果的解读依赖于操作人员经验的主观判断的不足，提供如上所述抗体组合的用途，并根据染色结果对无精子症患者进行更加细致、客观的分类。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种快速评估睾丸组织生精功能的方法，以生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c-KIT、SCP3和PNA表达情况，根据检测结果评估患者生精功能。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒，所述试剂盒包括抗体染料试剂D1和试剂D2，所述试剂D1由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成；所述试剂D2由荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成。进一步，所述试剂盒还包括阴性对照抗体染料试剂D3，所述试剂D3由488驴抗兔IgG荧光二抗及555驴抗鼠IgG荧光二抗组成。进一步，所述试剂D1或试剂D2中的抗体不同的荧光标记，所述荧光标记为FITC标记或PE标记。进一步，所述试剂盒还包括染色辅助试剂。试剂A:红细胞裂解液；试剂B：4％多聚甲醛固定液；试剂C：含5％胎牛血清(BSA)，)和0.5％TritonX-100的PBS液；试剂E：荧光封片剂；试剂F：PBS液。进一步，所述试剂盒还包括使用说明书，染色所需的改良EP管。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合，所述抗体组合由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体和荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成的抗体组合物和荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成的抗体组合物组成。其中，GFRA1是一种精原干细胞的表面标志物，c-KIT是一种分化型精原细胞的表面标志物，SCP3是一种精母细胞核减数分裂前特异表达的蛋白，PNA则标记一种精子细胞和精子的顶体蛋白。进一步，所述阴性对照抗体组合还包括由488驴抗兔荧光二抗及555驴抗鼠荧光二抗组成的抗体组合物，当非特异性染色较多(某些特殊病例)或睾丸自发荧光较强时，对比阴性对照后可以避免假阳性结果。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的抗体组合制备快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒中的应用。进一步，还包含说明书，所述说明书记载以下内容：试剂准备阶段：用试剂C分别按一定比例(推荐1:500，可根据染色情况调整)稀释试剂D1、D2、D3，制成工作液。生精小管玻片制备阶段：(1)获取人生精小管(长度在3-5cm即可充分供检测使用)，放入改良EP管的上层滤网中，在试剂F(PBS液)中漂洗3分钟；(2)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂B，室温孵育10min；(3)(可选步骤，用于取得的睾丸组织含血块、血液较多的情况)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂A，室温摇床放置10分钟；(4)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；(5)(可选步骤，当染色背景较高时选做)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂C，室温孵育30-60min；(6)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其分成三等份，分别放入三个新的改良EP管滤网中，分别放入D1、D2、D3工作液500ml室温孵育15-30min；(7)取出滤网弃下层废液，加入1ml试剂F洗涤3min，重复两次；(8)取出生精小管放置在一载玻片上，小心将其尽量铺展开，使用试剂E封片处理，在荧光显微镜下观察，根据观察结果，判断受试者的生精功能情况。进一步，说明书还包括典型的染色结果图和常用的睾丸生精情况分类方法以供参考，所述分类方法记载以下内容：睾丸生精情况的病理分类主要分为三种类型，分别为生精正常、生精阻滞、无生精或生精低下；(1)所述生精正常判断标准为：所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性；(2)所述生精阻滞判断标准为：①所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阴性；②所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阴性和PNA阴性；③所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阴性、SCP3阴性和PNA阴性；(3)所述无生精或生精低下判断标准为：①无生精：所有生精小管GFRA1阴性、c-KIT阴性、SCP3无性、PNA阴性；②生精低下：所有生精小管GFRA1阳性、c-KIT阳性、SCP3阳性和PNA阳性但是数量偏低或者生精灶只存在于生精小管的部分区域。本专利技术提供了一种全新的术中评估患者睾丸生精情况的方法，可以在术中快速有效查找和区分患者睾丸生精小管内的生殖细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速评估睾丸组织生精功能的方法，其特征在于，以人类生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c‑KIT、SCP3和PNA蛋白的表达情况，根据检测结果评估患者生精功能。

【技术特征摘要】
1.一种快速评估睾丸组织生精功能的方法，其特征在于，以人类生精小管作为检测样品，通过免疫组织化学荧光染色检测样品GFRA1、c-KIT、SCP3和PNA蛋白的表达情况，根据检测结果评估患者生精功能。2.一种用于快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光标记的染料试剂D1、试剂D2，所述试剂D1由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体及荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成；所述试剂D2由荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照抗体染料试剂D3，所述试剂D3由488驴抗兔IgG荧光二抗及555驴抗鼠IgG荧光二抗组成。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：试剂A:红细胞裂解液；试剂B：4％多聚甲醛固定液；试剂C：含5％胎牛血清(BSA)和0.5％TritonX-100的PBS液；试剂E：荧光封片剂；试剂F：PBS液。5.由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体和荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成的抗体组合物和由荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成的抗体组合物联合在制备快速评估睾丸组织生精功能的试剂盒中的应用。6.一种用于快速评估睾丸组织生精功能的抗体组合，所述抗体组合由荧光标记的兔抗人源GFRA1抗体和荧光标记的鼠抗人源c-KIT抗体组成的抗体组合物和荧光标记的兔抗人源SCP3抗体及荧光标记的鼠抗人源PNA抗体组成的抗体组合物组成。7.权利要求1所述的方法、权利要求2-4所述的试剂盒、权利要求5所述的应用或权利要求6所述的抗体组合，其特征在于，还包含操作说明书，所述操作说明书记载以下内容：试剂准备阶段：用试剂C分别按一定比例稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮宇，姚晨成，李铮，李朋，孙红芳，田汝辉，万众，陈慧兴，杨超，朱子珏，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31