胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途制造技术

本发明专利技术属生物医学领域，涉及天然药物活性成分胡桃醌新的药用用途，具体涉及胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途。本申请经实验证实，联合使用胡桃醌和TRAIL能显著增强后者对人黑色素瘤细胞株MEWO和A2058两种肿瘤细胞株的杀伤作用，而单独应用TRAIL对人黑色素瘤细胞株MEWO和A2058细胞增殖和凋亡无明显作用。

【技术实现步骤摘要】
胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途
本专利技术属生物医学领域，涉及天然药物活性成分胡桃醌新的药用用途，具体涉及胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途。
技术介绍
有关文献公开了肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族的新成员。研究显示，所述的TRAIL与死亡受体结合,通过多种信号传导通路,诱导肿瘤细胞发生快速、高效的凋亡反应,而对正常细胞无明显毒性,有望成为一种新的肿瘤治疗手段。然而越来越多的研究表明,有若干肿瘤细胞对TRAIL的凋亡作用敏感性较低甚至完全耐受，因此，对TRAIL抗肿瘤疗效增敏显得十分必要。胡桃醌存在于胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃的未成熟的外果皮中。近年来的研究发现胡桃醌具有抗真菌、抗衣原体或抗HIV病毒、抗肿瘤、降血糖等生物活性。迄今，尚未见有关胡桃醌作为TRAIL增敏剂的报道。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供天然药物活性成分胡桃醌新的药用用途，尤其是胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供天然药物活性成分胡桃醌新的药用用途，尤其涉及胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途。本专利技术所述的胡桃醌具有如下化学结构：本申请进行了细胞试验，本专利技术的实施例中优选人黑色素瘤细胞株MEWO和A2058，分别检测单独应用TRAIL以及联合应用胡桃醌和TRAIL对上述细胞株的细胞毒性影响，以及对细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响，结果显示：单独应用TRAIL对人黑色素瘤细胞株(MEWO和A2058)细胞增殖和凋亡无明显作用；胡桃醌和TRAIL联合应用能显著增强后者对上述两种肿瘤细胞株的杀伤作用。本专利技术进一步提供一种具有TRAIL增敏作用的药物组合物，其包括作为活性成分的胡桃醌，以及药物学上可接受的载体。本专利技术中，所述的药物组合物中作为活性成分的胡桃醌可用于多种肿瘤的TRAIL增敏；本专利技术中，优选的肿瘤是黑色素瘤。附图说明图1，胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用，其中，A，胡桃醌化学结构图；B药物对MEWO细胞杀伤率；C，药物对A2058的杀伤率；T为TRAIL的缩写，浓度为25nM，JL为胡桃醌缩写。图2，胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，其中，A，药物对MEWO细胞凋亡影响(流式图)；B，药物对A2058细胞的凋亡影响(流式图)；C，药物对MEWO和A2058凋亡影响(凋亡率统计图)；T为TRAIL的缩写，浓度为25nM，JL为胡桃醌缩写，浓度为20μM。图3.胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的促凋亡蛋白表达，其中，A，药物对A2058细胞促凋亡蛋白PARP和caspase3的影响(weseternblot图)；B，药物对A2058细胞促凋亡蛋白(PARP、cleavedPARP)的影响(灰度值统计图)；C，药物对A2058细胞促凋亡蛋白(caspase3和cleavedcaspse3)的影响(灰度值统计图)；T为TRAIL的缩写，浓度为25nM。JL为胡桃醌缩写，浓度为20μM。具体实施方式实施例1材料与方法：1.细胞株：人黑色素瘤细胞株(MEWO、A2058)均购自ATCC。上述细胞株用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数为5％CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化传代，2～3d传代1次，实验选用对数生长期细胞。2.检测细胞毒性：分别调整MEWO和A2058细胞悬液浓度为1×105/mL,加入96孔培养板内,每孔100μL,置37℃5％CO2孵箱培养24h，吸除旧培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以胡桃醌(10，20μM)预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，加入TRAIL(25nM)，并设空白对照组、单纯TRAIL(25nM)组和单纯胡桃醌组(胡桃醌预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，不加入TRAIL)，每组均设6复孔。TRAIL作用24h后，每孔加入10μLMTT溶液,继续培养2h，吸除培养基，每孔加入100μLDMSO，震荡混匀5min后，采用酶标仪在570nm处检测各孔的吸光值，细胞杀伤率＝〔1-(加药组OD平均值)/(空白对照组OD平均值)〕×100％；3.检测细胞凋亡，分别调整MEWO和A2058细胞悬液浓度为5×105/mL，将细胞接种于6孔板，每孔1ml。待细胞生长达融合状态后，吸弃原培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以胡桃醌(20μM)预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，加入TRAIL(25nM)，并设空白对照组、单纯TRAIL(25nM)组和单纯胡桃醌组(胡桃醌预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，不加入TRAIL)。TRAIL作用24h后，把细胞上清吸至离心管内，细胞经胰酶消化后，移至与细胞上清相同的离心管内，1000rpm4℃离心5min，弃上清，用PBS洗1遍，弃上清，每管加10μLRNase，37℃孵育20min，随后加入10μLPI混匀后流式细胞仪上机检测；4.检测凋亡相关蛋白表达，调整A2058细胞悬液浓度为5×105/mL，将细胞接种于6孔板，每孔1ml。待细胞生长达融合状态后，吸弃原培养基，以新的含10％胎牛血清的DMEM培养基培养。以胡桃醌(20μM)预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，加入TRAIL(25nM)，并设空白对照组、单纯TRAIL(25nM)组和单纯胡桃醌组(胡桃醌预处理黑色素瘤细胞6h后PBS洗涤1次，换成新鲜含FBS培养基，不加入TRAIL)。TRAIL作用6h后细胞处理同上。收集细胞后加入蛋白裂解液，BCA法蛋白定量，上样每孔30μg蛋白，10％SDS-PAGE电泳，300mA转膜90min，5％牛奶封闭后，加入anti-Caspase3和anti-PARP抗体4℃孵育过夜，加入HRP标记二抗室温孵育1h，洗膜后ECL法曝光。实验结果显示：1.胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用，本实验用了检测细胞毒性的经典方法MTT，实验结果显示，单独应用TRAIL(25nM)对MEWO细胞的杀伤率约为18％；单独应用胡桃醌(10,20μM)对MEWO细胞的杀伤率为(5％，20％)；而采用TRAIL和胡桃醌(10,20μM)联合干预组对MEWO细胞的杀伤率分别为(30％，45％)；实验还显示，单独应用TRAIL(25nM)对A2058细胞的杀伤率约为25％；单独应用胡桃醌(10,20μM)对A2058细胞的杀伤率为(5％，40％)；而采用TRAIL和胡桃醌(10,20μM)联合干预组对A2058细胞的杀伤率分别为(35％，65％)(如图1所示)；2.胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，采用PI单标的流式细胞术检测结果表明，单独应用TRAIL(25nM)MEWO细胞的凋亡率(subG1％)不明显(3％)；单独应用胡桃醌(20μM)孵MEWO细胞的凋亡率(subG1本文档来自技高网...

【技术保护点】
胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途，所述的胡桃醌具有如下化学结构：

【技术特征摘要】
1.胡桃醌在制备TRAIL增敏剂中的用途，所述的胡桃醌具有如下化学结构：2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胡桃醌增强TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用，以及增强TRAIL对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，和增强TRAIL对肿瘤细胞的促凋亡蛋白表达。3.一种具有TR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘英超，陈燕，吴金峰，葛明旭，
申请(专利权)人：山东省立医院，
类型：发明
国别省市：山东,37