用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，所述检测方法以志贺氏菌ipaH基因为靶基因，建立了一种可以有效检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法。该方法特异性强，灵敏度高，检测限为3.5×10

Detection kit, detection method and application for Shigella

The present invention relates to the field of biotechnology, in particular for Shigella detection kit and detection method and application of the detection kit for real-time RPA detection of Shigella, the detection method for Shigella ipaH gene as the target gene, established a real-time fluorescent RPA method can effectively detect shigella. The method has strong specificity and high sensitivity, and the detection limit is 3.5 * 10

【技术实现步骤摘要】
用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用。
技术介绍
食源性疾病目前是全世界关注的重要公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，每年都会有数千万的人因感染食源性致病菌而发病，严重者导致死亡。志贺氏菌(Shigella)作为主要的食源性致病菌之一，在我国引起感染性腹泻的致病菌中居首位。志贺氏菌属由4种革兰氏阴性、非运动性、无芽孢形成的杆状细菌组成，分别是鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。毒力较强的志贺氏菌可以引起人类细菌性痢疾，可表现出轻度痢疾、发热、腹部绞痛以及严重的体液流失。目前的分子生物学检测方法可以有效地克服传统检测方法的部分劣势而被多数研究者所青睐，其中重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification,RPA)技术因其特异性强、灵敏性高、反应时间短、操作简便等优点而受到广泛的关注，具有巨大的发展前景。传统的志贺氏菌检测主要依赖于细菌培养及一系列的生化鉴定，检测周期较长，无法实现快速检测。目前已建立了多种志贺氏菌的检测方法。常规的检验程序需要增菌、选择性平板分离培养、生化试验、血清学分离鉴定等，耗时长，操作繁琐，难以满足大批量样品检测或突发公共卫生事件处理的需求。在分子生物学检测方面，常用的方法包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增法(LAMP)和基因芯片技术等。PCR反应由变性、退火、延伸三个基本步骤构成，反应完成后进行电泳检测，必要时需要对产物进行纯化或测序分析，一般需要经验丰富的技术人员进行操作，且需要昂贵的PCR仪。LAMP扩增目的片段时依赖于一种具有链置换特性的DNA聚合酶和4-6条能够识别靶序列六个特异区域的引物，引物设计较为繁琐，其扩增产物经电泳检测呈现出梯度条带，不易与非特异性条带区分。
技术实现思路
针对现有志贺氏菌检测程序复杂、引物设计繁琐、仪器昂贵等问题，本专利技术提供一种用于志贺氏菌的检测试剂盒。进一步地，本专利技术还提用于志贺氏菌的检测方法及应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'探针：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1-dT-GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。进一步地，本专利技术还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光RPA方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取基因组DNA；步骤2、采用上述用于志贺氏菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)作为靶基因，根据其保守序列设计特异性引物及exo探针，建立了用于食品中志贺氏菌快速检测的real-timeRPA方法。相对于现有技术，本专利技术提供的用于志贺氏菌检测的实时荧光RPA方法的建立，具有以下优势：(1)操作简便，仅需增菌提取核酸后即可上机检测，所有试剂均以冻干粉的形式保存在反应管中；(2)反应时间短，不需要热变性，20min内即可完成；(3)反应结果可直接观察，无需电泳检测；(4)便携式荧光检测设备的使用。本研究中使用的GenieIII等温扩增荧光检测系统紧凑小巧，轻便耐用，仅为1.75kg左右，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可用于微生物性食品中毒事件原因的现场检测。进一步地，本专利技术还提供所述的检测试剂盒或检测方法在志贺氏菌检测
的应用。本研究中运用建立的real-timeRPA方法，对人工污染志贺氏菌的不同样品进行检测，当样品污染量为46CFU/25g、增菌6h时，鸡肉中可检出志贺氏菌。本研究中real-timeRPA和real-timePCR检测结果一致，但是前者检测所需时间明显小于后者。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的real-timeRPA灵敏性试验结果示意图；图2是本专利技术对比例提供的real-timePCR灵敏性试验结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'探针：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1-dT-GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。优选地，所述检测试剂盒还包括冻干酶制剂和醋酸镁溶液。优选地，所述检测试剂盒的反应体系组成如下：2μL的10μM的上游引物，2μL的10μM的下游引物，0.6μL的10μM的探针，12.5μL的体积浓度为20％的聚乙二醇，1μL的病毒DNA模板，29.4μL的ddH2O。优选地，所述冻干酶制剂包括1mM的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μL的单链结合蛋白，120ng/μL的recA重组酶，30ng/μL的BsuDNA聚合酶，30ng/μL的Exo核酸外切酶，100mmol/L的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20％的聚乙二醇，5mM的二硫苏糖醇，100ng/μL的肌酸激酶。本专利技术还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光RPA方法，所述检测方法至少包括以下步骤：步骤1、从待测样品中提取基因组DNA；步骤2、采用上述用于志贺氏菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述DNA进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。优选地，所述等温扩增反应在温度设定为39℃的等温扩增荧光检测仪中进行，反应时间为20min。优选地，所述志贺氏菌的上、下游引物的终浓度均为0.4μM，探针的终浓度为0.12μM。优选地，所述志贺氏菌的DNA的提取包括以下步骤：将宋内氏志贺氏菌纯培养菌接种于8-12mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5'‑CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG‑3'下游引物：5'‑GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC‑3'探针：5'‑CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA‑FAM‑dT‑THF‑A‑BHQ1‑dT‑GATACCGGCGCTCTGCTC‑C3‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'探针：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1-dT-GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。2.如权利要求1所述的用于志贺氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括冻干酶制剂和醋酸镁溶液。3.如权利要求1或2所述的用于志贺氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒的反应体系组成如下：2μL的10μM的上游引物，2μL的10μM的下游引物，0.6μL的10μM的探针，12.5μL的体积浓度为20%的聚乙二醇，1μL的病毒DNA模板，29.4μL的ddH2O。4.如权利要求2所述的用于志贺氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述冻干酶制剂包括1mM的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μL的单链结合蛋白，120ng/μL的recA重组酶，30ng/μL的BsuDNA聚合酶，30ng/μL的Exo核酸外切酶，100mmol/L的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20%的聚乙二醇，5mM的二硫苏糖醇，100ng/μL的肌酸激酶。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建昌，刘立兵，孙晓霞，娄巧哲，南汇珠，
申请(专利权)人：河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河北,13