一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物制造技术

本发明专利技术涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于治疗或预防由RPE65基因突变引起的2型Leber先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA2)。本发明专利技术的基因治疗载体包含人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)、启动子及增加基因表达的血管紧张素II型受体内含子1。本发明专利技术还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合物。

A gene therapy gene vector and ray PAT'S for the treatment of congenital amaurosis type 2 disease

The invention relates to a gene therapy vector, the vector of gene therapy for the treatment or prevention caused by mutations in the RPE65 gene type 2 Leber congenital amaurosis (Leber 's congenital amaurosis, LCA2). The gene therapy vector of the present invention contains human retinal pigment epithelial cell major protein 65 (hRPE65), promoter and angiotensin II type 1 receptor (II), which increases gene expression. The present invention also relates to drugs and compositions comprising the gene therapy vectors.

【技术实现步骤摘要】
一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物
本专利技术属于基因工程
，更具体地，本专利技术涉及一种用于LCA2的基因治疗载体及相关药物。
技术介绍
Leber先天性黑蒙症(Leber’scongenitalamaurosis,LCA)，是发生最早、最严重的遗传性视网膜病变,出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能完全丧失，导致婴幼儿先天性盲。LCA占遗传性视网膜病变的5％以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病(占10％-20％)。多呈常染色体隐性遗传，临床上以眼球震颤、固视障碍、畏光、指压眼球为特征。眼底检查早期多为正常，随着病变进行性进展，数年后可见眼底椒盐样色素沉着、骨细胞样色素、视网膜血管狭窄、广泛视网膜色素上皮和脉络膜萎缩。视网膜电图表现为a、b波平坦，甚至消失。可伴有圆锥角膜、远视、发育迟缓和神经系统异常等。传统医疗手段对遗传性视网膜疾病没有作用，所以到目前为止这类疾病还处于无药可治的状态。近年来，随着基因检测技术的发展，我们逐渐了解这类隐性视网膜遗传病是由基因突变造成的相应功能性蛋白缺失导致的。有研究发现18种与LCA相关的致病基因，主要包括视网膜色素上皮细胞蛋白65(retinalpigmentepithelial(cells)65kDaprotein，RPE65)，GUCY2D,CRX,RPGRIP1，CRBI和AIPL1等。其中以RPE65基因突变引起LCA2的研究最为深入和成熟。Leber先天性黑蒙中有约10％的患者为LCA2型，是由RPE65基因突变引起的。RPE65基因编码蛋白是一种相对分子质量为65KD的视网膜色素上皮的主要蛋白，帮助感光细胞制造视紫红质，而视紫红质是一种吸收光后能造成自身结构变化进而引起视讯号形成及传导的色素。RPE65能够催化全反式视黄醇异构化为11-顺-视黄醇，恢复视紫红质结构，维持视紫红质的再循环，维持视功能。Rpe65突变导致全反式视黄酯积累/不能再生视紫红质，造成视功能障碍。随着生物技术的发展，基于腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。但也有研究指出，应用重组病毒运送载体至眼内，同时在眼内表达治疗性的基因产物，还存在许多问题，如表达效率低，持续时间短，潜在的细胞毒性等。因此，亟需找到一种可靠、有效的给药载体，达到持续、高效、安全地治疗LCA2的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗LCA2的相关药物。在本专利技术的第一方面，提供一种腺相关病毒载体，所述载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、血管紧张素II型受体内含子1和人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)的基因序列，所述的RPE65蛋白选自与SEQIDNO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQIDNO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。优选地，所述的RPE65蛋白选自与SEQIDNO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQIDNO:2有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的RPE65蛋白的核苷酸序列含有SEQIDNO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列含有SEQIDNO:2。最优选地，所述的RPE65蛋白的核苷酸序列选自SEQIDNO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列选自SEQIDNO:2。在上述任一优选例中，所述的非特异性启动子为Chickenbeta-actin(CBA)的启动子，选自与SEQIDNO:3有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CBA的启动子选自与SEQIDNO:3有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO:3。在另一优选例中，所述的特异性启动子为视网膜色素上皮特异的VMD2启动子，选自与SEQIDNO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。优选地，所述的VMD2启动子选自与SEQIDNO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的(CBA)的启动子选自与SEQIDNO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO:3。在另一优选例中，所述腺相关病毒载体的序列含有(a)SEQIDNO:1；和(b)SEQIDNO:2；和(c)SEQIDNO:3或SEQIDNO:4。在上述任一优选例中，增强子为CMV，选自与SEQIDNO:5有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CMV选自与SEQIDNO:5有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQIDNO:5。在上述任一优选例中，腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAVclone32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5。更优选地，腺相关病毒选自AAV2和AAV5。最优选地，腺相关病毒选自AAV2。在上述任一优选例中，腺相关病毒为自我互补AAV。在上述任一优选例中，所述载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQIDNO:14有至少90％同源性的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体序列含有SEQIDNO:6或SEQIDNO:7。在本专利技术的另一方面，提供一种用于治疗LCA2的药物组合物，所述的腺相关病毒载体和药学上可接受的载体。在本专利技术的另一方面，提供所述的腺相关病毒载体在制备治疗LCA2的药物中的应用。在本专利技术的另一方面，提供一种基因治疗LCA2的方法，将所述的腺相关病毒载体眼内注射，恢复正常hRPE65蛋白的表达。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。本专利技术的有益效果在于，采用血管紧张素II型受体内含子1增加hRPE65蛋白在视网膜的表达使之得以高效、持续和稳定的表达，并提高其对LCA2的治疗效果。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1.AAV2载体的质粒模式图。质粒包含CBA启动子驱动的hRPE65cDNA，CMV和angiotensinIItype2receptor(AT2R)Intron1，SV40聚腺苷酸化信号，表达盒两侧是反向末端重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、血管紧张素II型受体内含子1和人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)的基因序列，所述的RPE65蛋白选自与SEQ ID NO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2016.04.11 CN 20161022159901.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、血管紧张素II型受体内含子1和人类视网膜色素上皮细胞主要蛋白65(hRPE65)的基因序列，所述的RPE65蛋白选自与SEQIDNO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQIDNO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的RPE65蛋白的核苷酸序列含有SEQIDNO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列含有SEQIDNO:2。3.如权利要求1中所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的非特异性启动子为Chickenbeta-actin(CBA)启动子，选自与SEQIDNO:3有至少95％同源性的核苷酸序列。4.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的特异性启动子为视网膜色素上皮特异的VMD2启动子，选自与SEQIDNO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。5.如权利要求1中任一权利要求所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列含有(a)SEQIDNO:1；和(b)SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞继景，
申请(专利权)人：沈阳复明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21