靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用，涉及免疫细胞领域，能够提高CAR‑T细胞治疗中T细胞活化能力，克服转染效率不足的问题，对CD19的杀伤能力强。该靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构、4‑1BB的胞内信号结构以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

Chimeric antigen receptor T cell targeting CD19 and its preparation method and Application

The present invention provides targeted chimeric antigen receptor T CD19 cells, preparation method and application, relates to the field of immune cells, T cell activation can improve the ability of CAR T cells in the treatment of, overcome the problem of insufficient transfection efficiency of CD19 cells. The target CD19 chimeric antigen receptor T cell surface expression of targeting chimeric antigen receptor gene CD19, the targeted chimeric antigen receptor gene CD19 from the CD28 hinge region of CD19 single chain antibody CD19ScFv, CD8 and transmembrane region and intracellular signal structure, 4 1BB intracellular signal structure the signal and intracellular domain of CD3 zeta series composition, its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:2.

【技术实现步骤摘要】
靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用
本专利技术涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用。
技术介绍
B细胞恶性肿瘤是血液系统一组恶性异质性疾病，包括急性和慢性B淋巴细胞白血病以及一些淋巴瘤亚型，因其复发率高、预后差，是临床较难治愈的血液系统恶性肿瘤。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原，不仅表达于正常前B细胞和成熟B细胞表面，也广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达，血液中也未曾检测到CD19可溶性蛋白的存在。此外，CD19分子在膜上的分布比较暴露，易与单克隆抗体结合，且结合后无显著内化、脱落以及抗原调变的发生，因此它被认为是治疗B细胞肿瘤的一个理想靶点。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor)，是人工合成的T细胞受体，结构上是由胞外靶向连接区以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。嵌合抗原受体T细胞是最具前景的肿瘤细胞免疫治疗方式之一。通过将患者的T细胞“重编码”，使其可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至细胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。通过这种靶向治疗可以有效治疗肿瘤甚至达到治愈的效果。相比于传统的治疗方法，CAR-T治疗展现出巨大的优势，如对肿瘤的特异性杀伤，只要表达它所针对的靶点就能杀伤，杀瘤范围广，并且对转移性和复发性肿瘤都有效。虽然CAR-T治疗在临床上取得了很好的疗效，尤其是靶向CD19的CAR-T治疗更是使CD19阳性的淋巴细胞白血病患者达到90％的缓解率，但是CAR-T细胞的制备过程中所涉及到的步骤和细节很多，如T细胞的活化，转染以及扩增等等，任何环节的不足都是限制CAR-T细胞广泛开展和应用的主要因素，目前尚未在体内比较第二代和第三代CAR的报道，两代CAR之间的差异可能不止来自于信号传导域，胞外的抗原结合域(scFv)、重组T细胞的转染方法、重组T细胞的回输方式等均可能影响CAR-T细胞的最终抗肿瘤效果。CN106754725A公开了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用，制备方法并没有优化，靶细胞的杀伤率仅在75％左右，CAR-T细胞的活化能力不强。因此，本领域亟需开发和优化CAR-T结构和制备方法，促使细胞扩增，提高肿瘤细胞杀伤效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用，提高CAR-T细胞治疗中T细胞活化能力，克服转染效率不足的问题，对CD19的杀伤能力强。本专利技术一方面提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQIDNO:2所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。作为优选技术方案，CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术另一方面提供了靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段，连接，转化，挑取单克隆，提取质粒，经过酶切和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；(2)慢病毒的制备提取慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv,辅助质粒psPAX2和pMD2.G，测定质粒浓度，配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，分离得慢病毒浓缩液；(3)T细胞的分离和培养取健康外周血，分离淋巴细胞，刺激培养24-48h。(4)T细胞的感染和扩增将上述刺激培养的T细胞接种到培养板，加入步骤(2)的慢病毒浓缩液，感染8-12h，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。作为优选技术方案，在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点BamH1和Sal1,与慢病毒表达载体Plv-EF1a用限制性内切酶BamH1和Sal1进行双酶切。作为优选技术方案，所述配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，分离得慢病毒浓缩液的具体操作为：取细胞状态良好的HEK293T/17细胞培养，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以9:6:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清DMEM培养基配制转染体系，孵育后共转染HEK293T/17细胞，12h后更换培养液；分别在转染换液后24h、48h时收集病毒上清，离心，过滤，过滤后的病毒液超速离心，弃掉上清，沉淀用无血清培养液重悬，得慢病毒浓缩液。作为优选技术方案，所述T细胞的分离和培养的具体操作为：取健康外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心，得分离的淋巴细胞；分离后的淋巴细胞用T淋巴细胞培养液加2％体积的自体血浆重悬，并调整细胞密度，接种于浓度为5ug/ml的CD3和CD28抗体包被的培养板中，刺激培养24h-48h。作为优选技术方案，含有2％体积的自体血浆的培养板中补充终浓度为500U/ml的重组人白介素2，25ng/ml的重组人白介素7和50ng/ml的重组人白介素15。本专利技术另一方面提供了靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞在制备抗B细胞恶性肿瘤药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的积极和有益效果在于：1、本专利技术的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，靶向CD19的嵌合抗原受体基因中CD19的单链抗体CD19ScFvCD19序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化得到，与CAR-T细胞的杀伤效果密切相关，显著提高了CAR-T细胞对CD19的杀伤能力。2、本专利技术的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备方法经过步骤的优化，使得制备的CAR-T细胞的活化能力强，CD3的比例高，T细胞的转导效率高。3、本专利技术的制备方法能更有效的刺激T细胞增殖，提高所得T细胞的数量和质量，保证足够数量的CAR-T细胞发挥好的杀伤效果。附图说明图1为本专利技术实施例的含有靶向CD19的嵌合抗原受体基因的慢病毒质粒结构示意图；图2为本专利技术实施例的慢病毒表达载体Plv-EF1a-CD19ScFv的限制性内切酶BamH1/Sal1双酶切片段的电泳鉴定图；图3为本专利技术实施例的流式细胞仪检测培养前后CD3阳性T细胞的比例图；图4为本专利技术实施例的流式细胞仪检测感染后T细胞表面Fab即CAR的表达水平图；图5为本专利技术实施例的流式细胞仪检测不同效靶比时，靶细胞被T细胞杀伤的比例变化图；图6为本专利技术实施例的LDH细胞毒性检测不同效靶比时，靶细胞被T细胞杀伤的比例变化图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚本文档来自技高网...

【技术保护点】
靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，其特征在于，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4‑1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，其特征在于，所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。3.权利要求1或2所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段，连接，转化，挑取单克隆，提取质粒，经过酶切和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；(2)慢病毒的制备提取慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv,辅助质粒psPAX2和pMD2.G，测定质粒浓度，配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，分离得慢病毒浓缩液；(3)T细胞的分离和培养取健康外周血，分离淋巴细胞，刺激培养24-48h。(4)T细胞的感染和扩增将上述刺激培养的T细胞接种到培养板，加入步骤(2)的慢病毒浓缩液，感染8-12h，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。4.根据权利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：汝昆，陈树英，宋鸽，蔺亚妮，魏万旭，
申请(专利权)人：青岛协和华美医学诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37