一种白血病的B细胞微小残留检测的方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种白血病的B细胞微小残留检测的方法。本发明专利技术针对人BCR的可变区V区(variable)设计10条上游引物序列，针对BCR的A、D、M、G基因恒定区(constant)各设计1条下游引物序列，针对BCR的E基因恒定区设计2条下游引物序列，并通过多重PCR扩增出目的序列，目的序列纯化后在产物序列3’末端添加碱基A并与接头序列连接，对含接头的连接产物用测序引物进行PCR扩增，获得扩增产物，经纯化、测序，测序结果与癌细胞RNA扩增产物序列比对。此方法灵敏度高达10

A method for detecting minimal residual of B cells in leukemia

The invention relates to the field of biological detection technology, in particular to a method for detecting the minimal residue of B cells in leukemia. The invention of variable zone V for human BCR (variable) 10 primers for BCR sequence, A, D, M, G constant region gene (constant) in the design of 1 downstream primers, 2 primer sequences were designed according to the constant region of E gene BCR, and amplified by multiplex PCR objective to sequence, sequence of purified products at the 3 'end sequence added base A and connected with the joint sequence and sequencing of PCR amplified products containing connection joint, obtained after purification, amplification, sequencing, sequencing results and cancer cell RNA amplified sequences than on. The sensitivity of this method is as high as 10

【技术实现步骤摘要】
一种白血病的B细胞微小残留检测的方法
本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种白血病的B细胞微小残留检测的方法。
技术介绍
急性淋巴细胞白血病(ALL)是最常见的成人急性白血病之一，它是一类以原幼淋巴细胞恶性增殖、蓄积、浸润为特点的恶性血液病。多项研究报道采用系统治疗方案，ALL患者完全缓解率(CR)达70％～90％,3-5年无病生存率为60％。尽管成人ALL的初治CR率己有明显提高，但复发率高，长期生存率仍较低。同样，儿童急性髓细胞白血病(acutemyeloidleukemia,AML)占儿童急性白血病(acuteleukemia,AML)的20％左右，却占儿童AL病死人数的50％以上。目前使用新型药物及造血干细胞移植的先进治疗方案可使患者获得接近70％的长期无病生存(diseasefreesurvival,DFS)和超过50％的5年无事件生存率(eventfreesurvival,EFS)，但是复发率和病死率同样较高。发生类似以上复发死亡的主要原因就是微小残留病(MRD)所引起。急性淋巴细胞白血病在发病时体内大约有1012左右的白血病细胞，但经过多种化疗药物的联合应用，在达完全缓解时，体内仍剩余I08-1010左右的白血病细胞，但这些残余白血病细胞通过现行形态学检测己无法做出准确的测评，且这些残存白血病细胞即是白血病复发的根源，因此这种白血病完全缓解后体内仍残存白血病细胞的状态称为微小残留病变(minimalresidualdisease,MRD)。目前MRD检测技术主要是流式细胞术(flowcytometry,FCM)及多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术。虽然PCR灵敏度高，但可用于PCR监测的融合基因较少，使用范围窄；基因突变、原癌基因过表达虽然覆盖率高，但是灵敏度低；而FCM适用于大部分患者，结果准确、快速、费用低、灵敏度高，可达10-3～10-4。虽然mpFC对于复发疾病的检测灵敏度为104，但是复杂的多维数据依赖于实验人员分析，人为因素影响大，不利于临床标准化检测。此外，在化疗后白血病抗原的表达水平对MRD的mpFC检测具有干扰作用。依赖于分子手段可以提高检测MRD的灵敏度，可以达到105；然而，实时定量PCR需根据患者设计特殊的引物将多样性丰富的重排序列扩增出来，其检测费用昂贵、劳动力密集、很难形成标准化实验流程。得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。因此，本研究提供一种用于B细胞白血病微小残留病检测的方法。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供了一种能高通量检测微小残留的白血病细胞的方法，此方法灵敏度高达10-6，检测覆盖面广，可检测几乎所有的B细胞受体。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，包括如下步骤：(1)收集样本RNA及癌细胞RNA，经凝胶电泳检测、Nanodrop测定其浓度后保存；(2)分别对样本RNA及癌细胞RNA通过一步RT-PCR的方法获得多重PCR产物；(3)分别磁珠纯化多重PCR产物，除去多余的引物；(4)在纯化后的多重PCR产物的3’末端添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的PCR产物；(5)将具有3’粘性末端A的PCR产物与接头序列相连，获得含接头的连接产物；(6)对含接头的连接产物用测序引物进行PCR扩增，获得扩增产物，经纯化、测序，样本RNA扩增产物序列与癌细胞RNA扩增产物序列比对。进一步地，所述步骤(2)中一步RT-PCR反应的体系中，模板量为50～500ng/20μl。进一步地，所述步骤(2)中一步RT-PCR引物包括针对人BCR的可变V区设计的10条上游引物、针对BCR的A、D、M、G基因恒定区(constant)各设计的1条下游引物和针对BCR的E基因恒定区设计的2条下游引物，10条上游引物的序列为SEQIDN0:1～SEQIDN0:10，6条下游引物的序列为SEQIDN0:11～SEQID:16。进一步地，所述一步RT-PCR中各上游引物等摩尔混合，引物总浓度为10μmol，下游引物总摩尔量与上游引物总摩尔量相同。进一步地，所述步骤(3)所述的磁珠纯化PCR产物的具体步骤为：a)取出磁珠振荡混匀5min，取出45μl/个样本的量放于室温10min；b)RT-PCR的产物各取出20μl，向每个样本中加入30μlH2O，按照45μl/个样品加入磁珠，用枪吸吹约10次混匀，放于室温2min；c)开盖放于磁力架上1min左右，液体变得澄清即可吸出液体，加入125μl85％的乙醇，1min后洗出弃掉，磁珠放于室温8min(5-10min)晾干；d)加上30μlddH2O回溶。进一步地，所述步骤(4)中纯化后的多重PCR产物的3’末端添加碱基A的反应体系为：a)34μl纯化的多重PCR产物；b)5μlKlenow缓冲液；c)10μl1mMdATP；d)1μlKlenow片段。进一步地，所述步骤(5)中连接接头反应体系为：a)11μl步骤3的DNA；b)15μlDNA连接缓冲液；c)1μl1:20稀释的接头寡核苷酸；d)3μlDNA连接酶。进一步地，所述接头寡核苷酸中接头序列为：正链5’-3'：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT负链5’-3':ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG进一步地，所述步骤(6)中的测序引物是：第一测序引物：5"AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT第二测序引物：5"CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT进一步地，所述步骤(6)中的PCR扩增产物是采用琼脂糖凝胶分离、切取400bp上下边缘的片段进行纯化的本专利技术的有益效果：通过以上技术方案，本专利技术提供了一种用于高通量检测白血病的B细胞微小残留的方法，灵敏度高达10-6，检测覆盖面广，可检测几乎所有的B细胞受体。此方法解决了现有技术中检测白血病微小残留病时检测范围窄、灵敏度较低、成本高的问题。附图说明图1为本专利技术实施例1中加接头后筛选目的片段的琼脂糖凝胶电泳图；图2为本专利技术实施例1中IlluminaPCR扩增后所得PCR产物；图3为本专利技术用于B细胞白血病微小残留病检测的流程图。具体实施方式展示一下实例来具体说明本专利技术的某些实施例，且不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。非特殊说明，本专利技术实施例采用的试剂均为市售商品，本专利技术实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。实施例1：1.RNA提取：本专利技术实施例1提供了一种B淋巴细胞受体(BCR)RNA样品的制备方法，包括如下步骤：(1)收集的新鲜外周血样本各10毫升，按LymphoPrep试剂盒(Axis-shield,Cat.No.AS1114544UK)说明书操作，获得相对较纯的PBMC；(2)采将步骤(1)中所得的PBMC，采用TrizolReage，货号15596-018，规格200ml，厂家INVITROGEN试剂盒对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)收集样本RNA及癌细胞RNA，经凝胶电泳检测、Nanodrop测定其浓度后保存；(2)分别对样本RNA及癌细胞RNA通过一步RT‑PCR的方法获得多重PCR产物；(3)分别磁珠纯化多重PCR产物，除去多余的引物；(4)在纯化后的多重PCR产物的3’末端添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的PCR产物；(5)将具有3’粘性末端A的PCR产物与接头序列相连，获得含接头的连接产物；(6)对含接头的连接产物用测序引物进行PCR扩增，获得扩增产物，经纯化、测序，将样本RNA扩增产物序列与癌细胞RNA扩增产物序列比对。

【技术特征摘要】
1.一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)收集样本RNA及癌细胞RNA，经凝胶电泳检测、Nanodrop测定其浓度后保存；(2)分别对样本RNA及癌细胞RNA通过一步RT-PCR的方法获得多重PCR产物；(3)分别磁珠纯化多重PCR产物，除去多余的引物；(4)在纯化后的多重PCR产物的3’末端添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的PCR产物；(5)将具有3’粘性末端A的PCR产物与接头序列相连，获得含接头的连接产物；(6)对含接头的连接产物用测序引物进行PCR扩增，获得扩增产物，经纯化、测序，将样本RNA扩增产物序列与癌细胞RNA扩增产物序列比对。2.根据权利要求1所述的一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中一步RT-PCR反应的体系中，模板量为50～500ng/20μl。3.根据权利要求1所述的一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)中一步RT-PCR引物包括针对人BCR的可变V区设计的10条上游引物、针对BCR的A、D、M、G基因恒定区(constant)各设计的1条下游引物和针对BCR的E基因恒定区设计的2条下游引物，10条上游引物的序列为SEQIDN0:1～SEQIDN0:10，6条下游引物的序列为SEQIDN0:11～SEQID:16。4.根据权利要求3所述的一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，所述一步RT-PCR中各上游引物等摩尔混合，引物总浓度为10μmol，所述下游引物总摩尔量与所述上游引物总摩尔量相同。5.根据权利要求1所述的一种白血病的B细胞微小残留检测的方法，其特征在于，所述步骤(3)的磁珠纯化多重PCR产物的具体步骤为：1)取出磁珠振荡混匀5min，取出45μl/个样本的量放于室温10min；2)RT-PCR的...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷菁，赵双双，刘慧莹，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：武汉赛云博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42