靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种质粒，核酸序列如SEQ ID No:1所示；还公开了一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，是将如SEQ ID No:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到的能够稳定表达Gluc的细胞系；还公开了药物筛选细胞模型的构建方法；还公开了该细胞模型在筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物中的应用。本发明专利技术构建的靶向HBV核心启动子的抗HBV药物细胞模型可以用来高通量地筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物，从而有助于开发新型抗HBV药物，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有非常好的应用价值。

Anti HBV drug screening cell model targeting HBV core promoter and its construction and Application

The invention discloses a plasmid DNA sequence is shown as SEQ ID No:1; also discloses a target cell screening model to the HBV core promoter of anti HBV drugs, such as SEQ ID is shown in the No:1 plasmid was transfected into A cells prepared by lentivirus, and then cultured cells the in vitro B lentivirus infection, the screened cell lines stably expressing Gluc; also discloses a construction method of drug screening cell model; and also discloses the application of cell model has inhibitory compounds in the screening of HBV core promoter activity. The invention constructs targeting the HBV core promoter of anti HBV drug cell model can be used for high-throughput screening is inhibited by the compounds of HBV core promoter activity, so as to contribute to the development of new anti HBV drugs in hepatitis B virus related scientific research and antiviral drug screening has very good application value.

【技术实现步骤摘要】
靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种药物筛选细胞模型，具体涉及一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一项严重的公共卫生问题，其涉及范围广泛，全球有近4亿慢性感染患者，而慢性HBV感染可以导致肝硬化、肝细胞癌等严重后果，每年因此死亡者近百万，在我国，需要治疗的慢乙肝患者约有2500万。HBV属于嗜肝DNA病毒。HBV感染细胞后，在胞浆脱去包膜，其基因组(rcDNA)被运送释放到细胞核，形成共价闭合环状DNA(cccDNA)，cccDNA是各种病毒蛋白mRNA的转录模板，在宿主细胞RNA聚合酶II、转录因子及转录调节因子作用下，产生3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.7kbmRNA。3.5kb的前基因组RNA(pgRNA)可翻译产生Core及Pol蛋白，Core、Pol与pgRNA相互作用，在形成核壳的同时将pgRNA及Pol蛋白包裹进核壳，在核壳内，Pol以pgRNA为模板，先合成负链DNA，然后以该链为模板合成正链，含有成熟rcDNA的核心颗粒在内质网被外膜蛋白包裹然后分泌出胞。从上述HBV在细胞内的复制过程可知，从cccDNA转录产生pgRNA是很重要的步骤。pgRNA的转录是由HBV核心启动子来起始的。1992年，Yuh等研究发现，HBVnt1744-1851是C启动子最短必需序列，称为基本核心启动子(basiccorepromoter,BCP)，它可以保证prC/pgRNA的正确转录；而nt1636-1744整体上能强烈促进C启动子活性(在HepG2细胞中使其活性增加1900倍)，称为C启动子上游调控序列(coreupstreamregulatorysequence,CURS)；CURS与增强子II(ENII)位于同一区域，CURS本身没有启动子活性，它对BCP的激活作用具有位置和方向依赖性，因而区别于ENII。在ENII上游，还存在另一增强子，即ENII，对核心启动子的活性也有促进作用。由于pgRNA转录，是HBV复制过程必不可少的环节，因此干扰该环节有可能成为治疗HBV感染的一种有效策略。然而，目前缺乏针对pgRNA转录环节的有效药物，因此筛选针对该环节的药物十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述问题，提供一种靶向HBV核心启动子转录的抗HBV药物筛选细胞模型及其构建和应用。本专利技术一方面提供了一种质粒，所述质粒的核酸序列如SEQIDNo:1所示。本专利技术的另一方面提供了一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，是将如SEQIDNo:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到的能够稳定表达Gluc的细胞系。所述体外细胞A为293FT细胞，所述慢病毒是将SEQIDNo:1所示的质粒、psPAX2和Pmd2.0G共转染293FT细胞制备得到。所述体外培养细胞B为HepG2细胞。本专利技术的另一方面提供了一种上述的靶向HBC二聚体形成的药物筛选细胞模型的构建方法，是将如SEQIDNo:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到能够稳定表达Gluc的细胞系，即得。在上述技术方案中，所述体外培养细胞为HepG2细胞。本专利技术的另一方面提供了上述的细胞模型在筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术得到的质粒plenti-Gluc-neo可以成功应用于药物筛选模型细胞系Hep-pcore-Gluc的构建当中，构建的药物筛选模型细胞系Hep-pcore-Gluc经实验证明能够稳定表达Gluc，成功筛选出了能够对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物。本专利技术构建的靶向HBV核心启动子的抗HBV药物细胞模型可以用来高通量地筛选对HBV核心启动子活性具有抑制作用的化合物，从而有助于开发新型抗HBV药物，在乙肝病毒相关科学研究以及抗病毒药物筛选方面有非常好的应用价值。附图说明图1是质粒plenti-Gluc-neo质粒结构示意图。图2是用本专利技术细胞模型进行化合物筛选的流程示意图。图3是用本专利技术细胞模型进行化合物初步筛选的部分结果图。具体实施方式本专利技术实施例中所用试剂来源如下：2×PrimeSTARHSMix：Takara公司，日本胶回收试剂盒，基因组DNA提取试剂盒：QIAGEN公司，德国质粒模板PCH9/3091由德国弗莱堡大学MichaelNassal构建质粒lentiCRISPRv2、psPAX2及Pmd2.0G由美国麻省理工大学张峰博士实验室构建，从美国公司Addgene购买质粒模板pCMV-Gluc：NewEnglandBiolabs公司，美国质粒模板pEGFP-N1：Clontech公司，美国大肠杆菌JM109、Rellina荧光素酶检测试剂盒，Glomax荧光素酶检测仪：Promega公司，美国BsmBI、Tangobuffer、DTT、Puromycin：Thermoscientific公司，美国DMEM：GIBICO公司，美国X-tremeGNENHP转染试剂：Roche公司，德国T7ligase：Enzymatics公司，美国ATP：NewEnglandBiolabs公司，美国PEG-itTMVirusPrecipitationSolution(5×)：SBI公司，加拿大Polybrene：Sigma公司，美国G418：Invitrogen公司，美国293FT细胞：Invitrogen公司，美国HepG2细胞：美国模式菌种收集中心本专利技术实施例中所用扩增引物序列如下：实施例1Hep-pcore-Gluc稳定表达细胞系构建一、核心启动子启动的Gaussia报告质粒plenti-pcore-Gluc构建以质粒PCH9/3091为模板，扩增包含增强子I，增强子II(CURS)和基本核心启动子(BCP)的区域。反应体系为：质粒PCH9/309110ng，引物F1070GG2(10μM)及R1901GG(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；94℃15s，58℃15s，72℃30s，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag1。以质粒lentiCRISPRv2为模板，用两个PCR反应，扩增慢病毒载体骨架。扩增反应体系为：质粒lentiCRISPRv220ng，引物Flentiv2flag(10μM)及Rlentiv213773(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃2min，35个循环。用胶回收试剂盒回收扩增片段，将该回收片段命名为frag2。片段frag3扩增反应体系为：质粒lentiCRISPRv220ng，引物Flentiv213769(10μM)及Rlentiv22607(10μM)各1μl，2XPrimeSTARHSMix25μl，灭菌超纯水补齐体积至50μl。反应条件：95℃预变性3m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒，其特征在于，所述质粒的核酸序列如SEQ ID No:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种质粒，其特征在于，所述质粒的核酸序列如SEQIDNo:1所示。2.一种靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，其特征在于，是将权利要求1中如SEQIDNo:1所示的质粒转染体外细胞A制备得到慢病毒，然后将该慢病毒感染体外培养细胞B，通过筛选得到的能够稳定表达Gluc的细胞系。3.一种如权利要求2所述的靶向HBV核心启动子的抗HBV药物筛选细胞模型，其特征在于，所述体外细胞A为293FT细胞，所述慢病毒是将SEQIDNo:1所示的质粒、psPAX2和Pmd2.0G共转染293FT细胞制备得到。4.一种如权利要求2所述的靶向HBV...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡接力，黄爱龙，魏霞飞，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50