The invention provides the preparation method of a new antibacterial peptide DLP2, and uses the genetic engineering technology to optimize the recombinant DLP2 gene expression in Pichia pastoris by optimizing the encoding antibacterial peptide gene. The invention for the first time the expression of antimicrobial peptide DLP2 in Pichia pastoris in the determination of fermentation, purification of Staphylococcus aureus ATCC 25923, ATCC 43300 and ATCC 6538 and CVCC 606 Streptococcus suis has significant antibacterial activity, MIC between 0.031 and 2 g/ml. The antibacterial peptide DLP2 prepared by the method can be used in the fields of antibacterial drugs, food additives, cosmetics, feed additives, etc., and has wide application value and market prospect.
【技术实现步骤摘要】
新型抗菌肽DLP2的制备方法
本专利技术属于生物
,具体地说,涉及一种新型抗菌肽DLP2的制备方法。
技术介绍
黑水虻抗菌肽DLP2是SungMoonYoe研究组以黑水虻(亮斑扁角水虻,Hermetiaillucens)为原料,通过金黄色葡萄球菌(S.aureusKCCM40881)进行免疫刺激从而产生的高效抗G+菌活性抗菌肽。抗菌肽DLP2是含有95个氨基酸残基的多肽序列,其中1~24位是信号肽序列,25~40位为前导肽序列,41~81位为成熟肽(DLP2)序列。DLP2理论分子量分别为4277.0Da,分子中具有2个组氨酸(His)和1个赖氨酸(Lys)以及5个精氨酸(Arg),在不同pH环境中,由于组氨酸解离状态不同,净电荷数在+2到+4之间变化(Soon-IkPark等,ParkSI,KimJW,YoeSM.Purificationandcharacterizationofanovelantibacterialpeptidefromblacksoldierfly(Hermetiaillucens)larvae.[J].Developmental&ComparativeImmunology,2015,52(1):98-106.)。抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注,也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽,稳定性不好,具有细胞毒性,抗菌活性不足,用药多样性,生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战。目前,尚未见到有关于DLP2在毕赤酵母中进行转基因表 ...
【技术保护点】
新型抗菌肽DLP2的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)基因表达框的设计:对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化,在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点,在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点,所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示;2)重组酵母表达载体的构建:将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后,与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接,得到的重组酵母表达载体pPICDLP2;3)重组酵母菌的制备:载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X‑33,筛选出高水平表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌;4)抗菌肽DLP2的制备:对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养,通过补加葡萄糖和甲醇诱导,获得发酵液,离心收集上清,上清经纯化后即得抗菌肽DLP2。
【技术特征摘要】
1.新型抗菌肽DLP2的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)基因表达框的设计:对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化,在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点,在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点,所得基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示;2)重组酵母表达载体的构建:将SEQIDNo:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后,与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接,得到的重组酵母表达载体pPICDLP2;3)重组酵母菌的制备:载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33,筛选出高水平表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌;4)抗菌肽DLP2的制备:对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养,通过补加葡萄糖和甲醇诱导,获得发酵液,离心收集上清,上清经纯化后即得抗菌肽DLP2。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)具体为:①种子液制备:挑取单菌落接种于YPD培养基中,28~30℃,250rpm振荡培养18~24h;然后按1%的接种量,转接至YPD培养基中,28~30℃,250rpm振荡培养16~18h,OD600达到4~6;然后,按10%接种量接到上罐培养基中,即200ml菌液+200ml45%葡萄糖+9.6mlPMT1,装液量为2L/5L,于29℃,800rpm,pH5.0,pO2>35%的条件下培养16-18h;②添加葡萄糖生长阶段:观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升,开始补加含12‰PMT1的50%葡萄糖溶液,添加时间6-8h,流速为30ml/L/h;③甲醇过渡诱导:添加葡萄糖6h后,饥饿1h,待葡萄糖耗尽后,开始补加含12‰PMT1的无水甲醇,补加过程中,流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h,直至发酵结束;④100%甲醇诱导阶段:甲醇过渡诱导6...
【专利技术属性】
技术研发人员:王建华,李占占,毛若雨,滕达,王秀敏,郝娅,
申请(专利权)人:北京生泰云科技有限公司,
类型:发明
国别省市:北京,11
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