用于根结线虫防治的方法和组合物技术

本发明专利技术公开了用于遗传防治由根结线虫属的线虫(根结线虫)引起的植物疾病的基因靶标、构建体和方法。本发明专利技术涉及通过确认目标编码序列和使用用于转录后阻抑或抑制植物寄生线虫细胞中的目标编码序列的表达的重组DNA技术获得植物保护效应。所公开的基因靶标在不同根结线虫种的直系同源基因之间在核苷酸水平上表现出显著的保守性，从而利于RNA干扰的属范围的靶标选择。

Methods and compositions for root knot nematode control

The present invention discloses gene targets, constructs and methods for genetic control of plant diseases caused by nematodes of root knot nematodes (root knot nematodes). The present invention is concerned with obtaining plant protection effects by confirming the target coding sequence and using recombinant DNA technology for expressing or inhibiting the expression of target coding sequences in plant parasitic nematode cells after transcription. The published gene targets show significant conservation at the nucleotide level between the orthologous genes of different root knot nematode species, thus favoring the target selection of RNA interference in the genus range.

【技术实现步骤摘要】
用于根结线虫防治的方法和组合物本申请是申请日为2009年04月10日和专利技术名称为“用于根结线虫防治的方法和组合物”的200980115310.5号专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2008年4月10日提交的美国临时申请61/044,015和2008年7月28日提交的美国临时申请61/084,205的优先权，其公开内容通过引用并入本申请中。通过引用并入计算机可读形式的序列表作为本公开的一部分的序列表包括2009年创建的名称为“MNDI004WO_ST25.txt”计算机可读形式的113KB的文件，其包含本专利技术的核苷酸序列。序列表的主题通过引用全部并入本申请中。专利
本专利技术一般涉及由植物寄生的线虫引起的疾病的遗传防治。更具体地，本专利技术涉及目标编码序列的确认，并涉及使用重组DNA技术在植物寄生线虫的细胞中进行转录后阻抑或抑制目标编码序列的表达，从而提供植物保护效果。专利技术技术植物受到多种潜在的引起疾病的物质的影响，包括植物寄生的线虫，其为生活在潮湿表面上或液体环境(包括土壤内的水膜和其它生物体内的湿润组织)中的活性的、柔软的、细长的生物体。有许多的植物寄生性线虫物种，包括各种根结线虫(例如根结线虫属(Meloidogyne)的种)、根腐线虫(lesionnematodes)(如短体线虫属(Pratylenchus)的种)、胞囊线虫(cystnematodes)(例如异皮线虫属(Heterodera)的种)、剑线虫(daggernematodes)(例如剑线虫属(Xiphinema)和茎线虫(stemandbulbnematodes)(例如茎线虫属(Ditylenchus)的种))及其它。垫刃线虫(Tylenchidnematodes)(垫刃目的成员)(包括异皮科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)和短体科(Pratylenchidae))是最大和最具经济重要性的一组植物寄生的线虫。线虫类通过一系列的生命周期阶段和蜕皮期生长。典型地，具有五个阶段和四个蜕皮期：卵阶段、J1(即第一幼虫阶段)、M1(即第一蜕皮期)、J2(第二幼虫阶段，有时由卵孵化)、M2、J3、M3、J4、M4、A(成虫)。幼虫(“J”)阶段有时也称为蚴(“L”)阶段。基因表达可能对于一个或多个生命周期阶段是特异性的。植物特异性和动物特异性的线虫种类已进化成为非常成功的寄生虫，并在农业和畜牧业方面造成重大的经济损失和造成人的疾病和死亡。植物的线虫寄生虫可以寄居在植物的所有部分，包括根、发育的花蕾、叶和茎。植物寄生虫根据其摄食习惯分成宽范围的迁移性外寄生虫(migratoryectoparasites)、迁移性内寄生虫(migratoryendoparasites)和定居性内寄生虫(sedentaryendoparasites)。定居性内寄生虫(包括根结线虫种类(Meloidogynespp.)和胞囊线虫(球形胞囊线虫属(Globodera)和异皮线虫)诱生摄食位点(feedingsite)(在根结线虫的情况中是“巨细胞”和在胞囊线虫的情况中是“合胞体”)并在根中形成长期的感染，这通常对作物造成非常大的危害。据估计，按所有主要作物每年估计平均12％的损失，寄生的线虫在全世界每年对园艺业和农业造成超过780亿美元的损失。例如，据估计线虫每年引起全世界大约32亿美元的大豆损失(Barker等,1994)。已经提供了几种形式的用于防治线虫感染的组合物、方法和药物。在许多情况下尝试了生物和耕作防治方法(包括植物检疫)。在某些作物中，已确认了提供线虫抗性或耐受性的植物抗性基因。化学组合物(如杀线虫剂)通常应用于其中存在植物寄生性线虫的土壤中。但是，存在着对安全和高效的线虫防治的急迫需求。与当前防治策略的劣势相关的因素包括对于农业可持续性的更高的关切和可能禁止或严厉限制许多可用的农业化学驱虫剂的使用的新政府法规。化学剂通常是非选择性的并对非目标生物体产生作用，从而在施用该化学剂后的一段时间内严重地破坏了有益微生物的种群。化学剂可能持久地存在于环境中且仅缓慢地代谢。杀线虫土壤薰剂(如三氯硝基甲烷和甲基溴及相关化合物)是高毒性的。甲基溴已被确认为消耗臭氧的化合物，且其在美国使用的注册已经被取消。这些药剂也可能累积在地下水或食物链中，并累积在较高营养层次的物种中。这些药剂也可能具有突变剂和/或致癌剂的作用以引起不可逆的和有害的遗传改变。因此，线虫防治的替代方法(如遗传方法)越来越多地受到研究。RNA干扰(“RNAi”)是利用内源细胞途径的方法，从而双链RNA(dsRNA)特异性的目标基因导致目标mRNA的降解。RNAi通过内源途径发挥作用，包括能够从原dsRNA产生大约21个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)的Dicer蛋白复合体和使用siRNA引导(siRNAguides)识别并降低或阻断相应mRNA的翻译的RNA-诱导沉默复合体(RISC)。仅与该siRNA互补的转录物受到影响，并因此mRNA表达的降低通常是序列特异性的。RNAi的基因沉默效应持续数天且在试验条件下可导致目标转录物丰度的90％或更高的下降，随之导致相应蛋白质水平的下降。附图简要说明图1显示了用于选择组合化学品(BASTA)和荧光(DsRed)以产生具有杀线虫目标基因(GOI)的均匀表达的毛根(Hairyroot)的毛根表达构建体的示意性实例。GOI可编码杀线虫核苷酸，如靶向于关键线虫基因的双链RNA(dsRNA)。卡那霉素抗性用于细菌宿主内的质粒扩增(plasmidpropagation)。BASTA(草铵膦铵盐:草胺膦)耐受性通过在甘露碱(mannopine)合成酶启动子和终止子的控制下的BAR基因(草胺膦乙酰转移酶)表达赋予。GOI可受到源自花椰菜花叶病毒35S启动子(35S)或玄参花叶病毒(FMV)的强组成型启动子的驱动，或者可以使用多种植物启动子(如泛素3启动子)和终止子(如E6、E9或章鱼碱合成酶(OCS)终止子)。红色荧光蛋白DsRed可由强组成型病毒启动子或其它启动子(如肌动蛋白7植物启动子)驱动，并使用终止子如E6、E9或OCS。图2显示了实施例2中使用的线虫评定量表(1-4)的例子。专利技术概述在一个方面中，本专利技术包括选自以下的多核苷酸：(a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46或SEQIDNO:47的任何核酸序列的至少21个连续核苷酸的片段，其中植物寄生的线虫摄取包含至少一个与所述片段互补的链的双链核糖核苷酸序列将抑制该线虫的生长；和(b)(a)中的序列的互补序列。在特定的实施方式中，该多核苷酸定义为与异源启动子可操作地连接。“异源的”意思是未发现天然地与所述多核苷酸结合的任何序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多核苷酸，包含：(a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的任一核酸序列的至少21个连续核苷酸的片段；和(b)(a)中片段的反向互补序列。

【技术特征摘要】
2008.04.10 US 61/044,015;2008.07.28 US 61/084,2051.一种多核苷酸，包含：(a)SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46或SEQIDNO:47的任一核酸序列的至少21个连续核苷酸的片段；和(b)(a)中片段的反向互补序列。2.权利要求1的多核苷酸，其中植物寄生的线虫摄取包含所述至少21个连续核苷酸的核糖核苷酸将抑制该线虫的生长。3.权利要求1的多核苷酸，定义为可操作地与外源启动子连接。4.权利要求1的多核苷酸，在所述片段和该片段的反向互补序列之间包含间隔多核苷酸序列。5.包含权利要求1的多核苷酸的转化载体。6.权利要求5的转化载体，其中所述多核苷酸可操作地与在植物细胞中发挥功能的外源启动子连接。7.从权利要求1的多核苷酸表达产生的双链核糖核苷酸分子，其中植物寄生的线虫摄取所述核糖核苷酸分子将抑制该线虫的生长。8.权利要求7的双链核糖核苷酸分子，其中所述核糖核苷酸分子在植物寄生的线虫中抑制基本上与所述多核苷酸分子互补的核苷酸序列的表达。9.用权利要求1的多核苷酸转化的细胞。10.权利要求9的细胞，定义为原核细胞。11.权利要求9的细胞，定义为真核细胞。12.权利要求9的细胞，定义为植物细胞。13.用权利要求1的多核苷酸转化的植物。14.权利要求13的植物，进一步定义为选自玉米、小麦、大麦、黑麦、稻、马铃薯、西红柿、黄瓜、辣椒、苜蓿、豆科植物、大豆、豌豆、紫花苜蓿、甘蔗、甜菜、烟草、胡萝卜、棉花、油菜籽(加拿大油菜)、向日葵、红花、高粱、草莓、香蕉、草皮和观赏植物的作物。15.权利要求13的植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸。16.权利要求13的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表达为双链核糖核苷酸分子。17.权利要求16的植物，其中植物寄生的线虫摄取包含所述双链核糖核苷酸分子的植物的组织将抑制该线虫的生长。18.权利要求17的植物，其中所述植物寄生的线虫是根结线虫种类(Meloidogynespp)。19.权利要求17的植物，其中所述植物寄生的线虫是南方根结线虫(Meloidogyneincognita)。20.由权利要求13的植物产生的商品，其中所述商品包含可检测量的所述多核苷酸或由其表达的核糖核苷酸。21.一种用于控制植物寄生线虫群体数量的方法，包括提供包含双链核糖核苷酸分子的药剂，该双链核糖核苷酸分子在被线虫摄取时发挥抑制线虫内的生物学功能的作用，其中所述药剂包含选自以下的核苷酸序列：SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46和SEQIDNO:47，及其互补序列。22.一种用于控制植物寄生线虫群体数量的方法，包括提供包含在由植物寄生的线虫摄取时发挥作用以抑制线虫体内的生物学功能的第一多核苷酸序列的药剂，其中该多核苷酸序列沿至少大约19-大约25个连续核苷酸表现出与源自线虫的转录序列的大约95％-大约100％的核苷酸序列同一性，并与第二多核苷酸序列杂交，该第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列互补，且其中所述源自线虫的转录序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46和SEQIDNO:47及其互补序列。23.权利要求22的方法，其中所述线虫是根结线虫种类。24.权利要求22的方法，其中所述线虫是南方根结线虫。25.一种用于控制植物寄生线虫的群体数量的方法，包括在植物寄生线虫的宿主植物中提供表达权利要求1的多核苷酸分子的转化植物细胞，其中该多核苷酸被表达以产生在由植物寄生的线虫摄取时发挥作用的双链核糖核酸，从而抑制所述线虫体内目标序列的表达并导致线虫或线虫群体的生长或繁殖相对于在缺乏所述转化植物细胞的宿主上的生长或繁殖降低。26.权利要求25的方法，其中所述线虫在感染宿主植物后表现出生长降低。27.权利要求25的方法，其中所述目标序列编码蛋白质，该蛋白质具有选自如下的预期功能：DNA复制、细胞周期控制、转录、RNA加工、翻译、核糖体功能、tRNA合成、tRNA功能、蛋白质运输、分泌、蛋白质修饰、蛋白质稳定、蛋白质降解、能量产生、线粒体功能、中间代谢、细胞结构、信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·布拉德利，B·恰瓦佩利，B·高，J·P·麦卡特，M·L·维布斯基，D·J·威廉斯，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US