灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用制造技术

本发明专利技术涉及灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用。该灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR的序列如SEQ ID NO.1所示。该降低灰飞虱抗药性的基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。该基因片段用于降低灰飞虱抗药性。本发明专利技术可用于检测灰飞虱的抗药性，并实现对灰飞虱的抗药性治理。

Gene fragment of resistance related estrogen receptor gene LSERR and resistance gene of BPH and its application

The present invention relates to the resistance gene related to insecticide resistance of the grey planthopper, LSERR, and the gene fragment which reduces the resistance to the Planthopper and its application. The sequence of sbph resistant estrogen related receptor gene LSERR as shown in SEQ ID NO.1. The small brown planthopper resistance reduced gene fragment sequences such as SEQ ID NO.3 shown. The gene fragment was used to reduce resistance to bph. The invention can be used to detect the resistance of the small brown planthopper, and to control the resistance of the small brown planthopper.

【技术实现步骤摘要】
灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用
本专利技术涉及一种灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用，属于生物

技术介绍
据专利技术人所知，在我国，灰飞虱分布遍及各省市，以长江流域和华北稻区发生较多。灰飞虱最重要的危害形式是种群暴发促进植物病毒病的流行，酿成巨大经济损失。目前主要以化学农药来防治灰飞虱，已造成灰飞虱对常用各类杀虫剂产生了不同水平的抗性，亟需通过对灰飞虱进行抗药性监测和抗药性形成机制的研究，开发出治理技术和策略，实现灰飞虱的可持续防治。专利技术人通过研究灰飞虱抗药性分子机制，找出灰飞虱的抗药性基因，并在此基础上通过实施喂食RNAi技术手段来降低灰飞虱抗药性。目前，专利技术人已将研究成果于2016年提交了两件专利申请，一为申请号CN201610432190.3，名称《灰飞虱抗药性基因CYP6AY3v2、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国专利技术专利申请，另一为申请号CN201610567595.8，名称《灰飞虱抗药性羧酸酯酶基因LSCE12、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用》的中国专利技术专利申请。如上述专利申请中所言，现有技术利用RNAi技术抗虫的思路主要有两种：第一种是找到害虫的致死基因，然后据此设计合成dsRNA，并通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖；第二种是找到害虫的致死基因，然后据此设计转基因农作物，使农作物具备能直接导致害虫死亡的能力。然而，在当前的实际情况下，社会公众对转基因技术普遍带有很深的误解，转基因农作物很难被直接接受；同时，能通过喂食直接导致害虫死亡、或直接导致害虫不能正常发育和繁殖的dsRNA，容易被社会公众误认为该dsRNA本身带有致死毒性、或发育/繁殖毒性，使这种dsRNA也不容易被接受。与之相比，专利技术人利用RNAi技术，通过喂食dsRNA降低灰飞虱抗药性，使灰飞虱更容易被杀虫剂杀灭，可有效避免社会公众产生类似的误解，这无疑会使后续的推广工作更加顺利。在此基础上，专利技术人仍在继续研究，以期找到灰飞虱的其它抗药性基因。
技术实现思路
本专利技术基于专利技术人的最新研究成果，提供一种灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR，利用该基因可获得降低灰飞虱抗药性的基因片段(即dsRNA)，通过喂食RNAi降低灰飞虱抗药性。同时，本专利技术还提供与该基因相应的降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR，其特征是，该基因的序列如SEQIDNO.1所示。该基因的核苷酸序列长度为1854bp，其中，开放阅读框为从5′端第379位到第1638位碱基，编码区长度为1260bp；5′端UTR区从第1位到第378位碱基，3′端UTR区从1639位到1854位碱基。该基因的等电点是6.75，分子重量是47.70kDa。由前文所述灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQIDNO.2所示。该多肽由419个氨基酸残基组成，其中，有250个属于极性氨基酸，有52个属于强酸氨基酸(Asp和Glu)，有51个属于强碱氨基酸(Arg和Lys)，有169个属于疏水性氨基酸。该多肽的第75-168位氨基酸和第194-416位氨基酸之间分别有一个NR_LBD_ERR结构域和NR_DBD_ERR结构域。采用APSSP2法预测该多肽的蛋白二级结构可知，α螺旋占43.53％，β折叠占5.49％，无规则卷曲占50.98％；其中，在NR_DBD_ERR结构域，有6个β折叠和3个α螺旋；在NR_LBD_ERR结构域，有3个β折叠和11个α螺旋。本专利技术还提供：降低灰飞虱抗药性的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQIDNO.3所示。前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段的合成方法，包括以下步骤：第一步、从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；所述灰飞虱材料至少包括灰飞虱卵、灰飞虱若虫、灰飞虱成虫之一；第二步、先以灰飞虱总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成灰飞虱cDNA模板；第三步、采用引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R、以及灰飞虱cDNA模板进行PCR扩增，获得dsRNA模板并进行纯化；其中，所述引物dsLSERR-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.5所示序列，所述引物dsLSERR-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQIDNO.7所示；第四步、采用纯化后的dsRNA模板，体外合成dsRNA并保存备用；所得dsRNA即为目标基因片段。该合成方法进一步完善的技术方案如下：优选地，第一步的具体过程为：采用总RNA提取试剂盒从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；以琼脂糖凝胶电泳纯化灰飞虱总RNA；以核酸蛋白定量仪检测灰飞虱总RNA的浓度以及吸光度值；将灰飞虱总RNA冻存；第二步的具体过程为：以灰飞虱总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链；然后，采用cDNA第一链，于PCR仪中合成灰飞虱cDNA模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得灰飞虱cDNA模板冻存；第三步的具体过程为：采用引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R、以及灰飞虱cDNA模板进行PCR扩增，并获得dsRNA模板，扩增时的PCR反应条件为：94℃3min，94℃30s，68℃30s以及72℃1min10个循环，94℃30s以及72℃1min28个循环，72℃10min，12℃保持；电泳纯化所得dsRNA模板，并以回收试剂盒进行纯化后保存；第四步的具体过程为：采用纯化后的dsRNA模板，以试剂盒体外合成dsRNA，并以2～5倍反应体系的无核酸酶水溶解所得dsRNA，然后冻存备用。更优选地，第一步中，冻存灰飞虱总RNA的温度为-80℃以下；第二步中，冻存灰飞虱cDNA模板的温度为-20℃±5℃；第三步中，纯化后保存dsRNA模板的温度为-20℃±5℃；第四步中，冻存dsRNA的温度为-80℃以下。前文所述合成方法中所用引物，其特征是，包括引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R，所述引物dsLSERR-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.5所示序列，所述引物dsLSERR-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术还提供：前文所述灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR的用途，其特征是，该用途为用于合成前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段。本专利技术还提供：前文所述降低灰飞虱抗药性的基因片段的用途，其特征是，该用途为用于降低灰飞虱抗药性。优选地，该用途为降低灰飞虱针对氟啶虫胺腈的抗药性。专利技术人经反复地深入实践研究发现，灰飞虱的雌激素相关受体基因LSERR是导致灰飞虱具有抗药性的关键基因，一方面，通过检测基因LSERR和/或其编码的多肽，可检测灰飞虱的抗药性，另一方面，通过以基因LSERR为模板最终体外合成dsRNA，并进行喂食RNAi，可有效降低灰飞虱的抗药性，实现对灰飞虱的抗药性治理。附图说明图1是实施例1中灰飞虱LSERR基因CDS全长电泳图本文档来自技高网...

【技术保护点】
灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR，其特征是，该基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR，其特征是，该基因的序列如SEQIDNO.1所示。2.由权利要求1所述灰飞虱抗药性雌激素相关受体基因LSERR编码的多肽，其特征是，该多肽的序列如SEQIDNO.2所示。3.降低灰飞虱抗药性的基因片段，其特征是，该基因片段的序列如SEQIDNO.3所示。4.权利要求3所述降低灰飞虱抗药性的基因片段的合成方法，包括以下步骤：第一步、从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；所述灰飞虱材料至少包括灰飞虱卵、灰飞虱若虫、灰飞虱成虫之一；第二步、先以灰飞虱总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；再以PCR合成灰飞虱cDNA模板；第三步、采用引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R、以及灰飞虱cDNA模板进行PCR扩增，获得dsRNA模板并进行纯化；其中，所述引物dsLSERR-F的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.5所示序列，所述引物dsLSERR-R的序列为5′端加有T7启动子序列的SEQIDNO.6所示序列，所述T7启动子序列如SEQIDNO.7所示；第四步、采用纯化后的dsRNA模板，体外合成dsRNA并保存备用；所得dsRNA即为目标基因片段。5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征是，第一步的具体过程为：采用总RNA提取试剂盒从灰飞虱材料中提取灰飞虱总RNA；以琼脂糖凝胶电泳纯化灰飞虱总RNA；以核酸蛋白定量仪检测灰飞虱总RNA的浓度以及吸光度值；将灰飞虱总RNA冻存；第二步的具体过程为：以灰飞虱总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链；然后，采用cDNA第一链，于PCR仪中合成灰飞虱cDNA模板，具体合成条件为：37℃15min，85℃5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐鹿，顾中言，李海东，许小龙，徐德进，徐广春，韩召军，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32