一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用，所述ES‑2‑AF肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物是由上述的ES‑2‑AF肽的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合而成，结构式为：HA‑CO‑NH‑(ES‑2‑AF)n。本发明专利技术的ES‑2‑AF肽与Anti‑flt1肽、ES2肽相比，保留甚至增强了抑制新生血管生成的能力。本发明专利技术的ES‑2‑AF肽的透明质酸化修饰物与ES‑2‑AF肽相比，保留了ES‑2‑AF肽抗新生血管生成与抗肿瘤活性，整合了大分子透明质酸抗新生血管生成等特性，使其具有稳定性更高、亲水性更强、靶向性更强等特性，因此具有更好的使用效果和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种新生血管生成抑制肽及其透明质酸修饰物的制备方法与应用。
技术介绍
内皮抑素(Endostatin，ES)是一种从血管内皮瘤中分离得到的20KDa的多肽，被确认为胶原蛋白XVIII的C端部分。内皮抑素能够直接靶向肿瘤附近的内皮细胞而不会对正常细胞产生明显毒性。它同样能抑制内皮细胞增生、迁移，引起细胞凋亡。其抗血管增殖活性通过调节血管内皮生长因子VEGF的表达而实现。ES-2(IVRRADRAAVP)是ES结构中一个具有明显抗新生血管生成、抗肿瘤活性的短肽段，更容易进入细胞内部，且更容易获得和改造，但是同ES一样，ES-2也存在体内半衰期短和稳定性差等缺点，这些缺点大大的限制了ES-2进一步的应用。Anti-flt1肽(GGNQWFI)能够特异性地与VEGFR1(fms-liketyrosinekinase-1orFlt1)结合，从而起拮抗作用阻止VEGFR1与VEGFA、VEGFB、胎盘生长因子PIGF等的结合。与其他VEGFR1的单克隆抗体或RNA拮抗剂不同，Anti-flt1肽是一种合成成本较低的非免疫原性的短肽。但是与ES-2等其他多肽相比，Anti-flt1肽的水溶性较差，这很大程度地影响了其作用的发挥。综上，现有的多肽类新生血管抑制剂多存在体内半衰期短、稳定性差等问题，限制了多肽类药物在制备新生血管抑制剂中的应用。因此，本领域迫切需要开发一种新型的多肽类新生血管抑制剂。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种ES-2-AF肽，该ES-2-AF肽在活性、溶解性、稳定性和半衰期等方面得到了改善，具有明显的抗新生血管生成作用。本专利技术的另一目的在于提供一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种ES-2-AF肽，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，具体如下：ES-2-AF肽：IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI；(SEQIDNO.1)。本专利技术将Anti-flt1肽与ES-2肽融合在一起，所得到的ES-2-AF肽在活性、溶解性、稳定性和半衰期等方面得到了很好的改善。本专利技术的ES-2-AF肽经Fmoc固相合成，由高效液相进行纯化，并质谱、高效液相色谱等手段进行了结构的确证，纯度均可达95％以上。本专利技术的第二方面，提供一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物，由ES-2-AF肽上的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合，结构式如下：HA-CO-NH-(ES-2-AF)n；式中，n＝30～60；ES-2-AF的分子量为2197.5Da，HA的分子量为240000Da。ES-2-AF的供给量(即上述结构式中n的取值)会影响与透明质酸(HA)的结合度，本专利技术对ES-2-AF的供给量进行了优化考察，综合考虑了对HA空间构象的影响以及ES-2-AF与透明质酸的结合度，优选n＝60。本专利技术的第三方面，提供上述ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法。本专利技术提供的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法，步骤如下：(1)制备HA-TBA结合物，改善HA的溶解性，使HA能够溶于有机溶剂；(2)将HA-TBA结合物溶于有机溶剂中，加入卡特缩合剂，以活化HA的羧基；然后将活化羧基后的HA-TBA、ES-2-AF肽和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)混合，反应24h后，加入NaOH溶液；再调节反应体系的pH降至3.0以终止反应；然后将反应体系的pH再升至7.0，反应产物经透析、干燥，即得ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。步骤(1)中，所述HA-TBA结合物的制备方法为：向Dowex离子交换树脂中加入过量的四丁基氢氧化铵(TBA-OH)，混匀，得到Dowex-TBA树脂，过滤除去上清；将透明质酸钠NaHA溶于水中，倒入制备的Dowex-TBA树脂中，混匀，过滤除去Dowex树脂，得到澄清的HA-TBA溶液，冻干，即得HA-TBA结合物。步骤(2)中，所述有机溶剂为DMSO。步骤(2)中，HA-TBA与ES-2-AF摩尔比为1:(4～100)。步骤(2)中，所述NaOH溶液的浓度为1M。步骤(2)中，采用1M的HCl调节pH降至3.0；采用1MNaOH将pH升至7.0。步骤(2)中，反应产物透析的方法为：将反应产物倒入预处理的透析袋(10kDa)，分别用NaCl溶液、25％乙醇和水透析。本专利技术通过制备HA-TBA结合物，改善了HA的溶解性，使本不溶于有机溶剂的HA能够溶于DMSO。过量的BOP使HA的羧基充分活化，使之与肽链的氨基反应形成酰胺键。卡特缩合剂是蛋白质、肽链反应中常用的方法，但是反应温度、反应体系的pH、反应时间等因素都对反应效率有很大影响。本专利技术通过优化卡特缩合剂的供给量、反应温度、反应体系的pH、反应时间等条件，成功制备出半衰期增长、活性更强的透明质酸化ES-2-AF肽修饰物。本专利技术的第四方面，提供上述ES-2-AF肽和/或ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备抑制新生血管生成的药物中的用途。进一步的，本专利技术还提供上述ES-2-AF肽和/或ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物在制备伴随新生血管生成疾病的治疗药物和/或抗肿瘤药物中的用途。所述伴随新生血管生成疾病包括糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变和关节炎等。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术通过调整ES-2-AF肽的供给量、反应温度、反应体系的pH、反应时间等条件，可以制备得到不同结合度的透明质酸－ES-2-AF肽结合物。(2)本专利技术制备的ES-2-AF肽与Anti-flt1、ES-2肽相比，其分子水平与细胞水平抗新生血管生成的作用均优于后两者。(3)本专利技术制备的ES-2-AF肽透明质酸化修饰物与ES-2-AF肽相比，其稳定性更高、生物活性更强。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1：ES-2-AF肽透明质酸化修饰物的核磁共振1H图谱；图2：Anti-flt1、ES-2、ES-2-AF对内皮细胞增殖的抑制作用；图3：Anti-flt1、ES-2、ES-2-AF可抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合；图4：ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF对内皮细胞增殖抑制作用；图5：ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF可抑制VEGF及其受体VEGFR1(Flt-1)结合；图6：ES-2-AF、HA&ES-2-AF、HA-ES-2-AF内皮细胞转移的抑制作用。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ES‑2‑AF肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种ES-2-AF肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。2.一种ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物，其特征在于，由权利要求1所述的ES-2-AF肽的氨基与透明质酸分子上的羧基通过酰胺键结合而成，结构式如下：HA-CO-NH-(ES-2-AF)n；式中，n＝30～60。3.根据权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物，其特征在于，结构式中n＝60。4.根据权利要求2所述的ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)制备HA-TBA结合物，改善HA的溶解性，使HA能够溶于有机溶剂；(2)将HA-TBA结合物溶于有机溶剂中，加入卡特缩合剂，以活化HA的羧基；然后将活化羧基后的HA-TBA、ES-2-AF肽和DIPEA混合，反应24h后，加入NaOH溶液；再调节反应体系的pH降至3.0以终止反应；然后将反应体系的pH再升至7.0，反应产物经透析、干燥，即得ES-2-AF肽的透明质酸化修饰物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述HA-TBA结合物的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭海宁，于洋，孙凤，邢亮，杨志芳，王振东，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37