miR‑664a‑5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。该试剂为微小RNA(microRNA,miRNA)miR‑664a‑5p检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。以唾液作为检测样本的检测肝癌的试剂盒含有蛋白酶和miR‑664a‑5p检测试剂。本发明专利技术首次在唾液中寻找到诊断肝癌敏感特异的生物标志物，对肝癌的早诊早治，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。

MiR 664a kit 5p applications in preparation of diagnostic reagent kit for hepatocellular carcinoma / in

The invention belongs to the field of biological medicine, and relates to a reagent and a kit for diagnosing liver cancer. The reagent for micro RNA (microRNA, miRNA) miR 664a 5p detection reagent, the reagent for the detection of object saliva samples. The saliva as a kit for detection of hepatocellular carcinoma samples containing protease and miR 664a 5p kit. It is the first time to find sensitive and specific biomarkers of liver cancer in saliva, which is of great significance for early diagnosis and treatment of liver cancer, reducing mortality, and reducing the burden of medical treatment in china.

【技术实现步骤摘要】
miR-664a-5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及miR-664a-5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒的应用，以及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。
技术介绍
我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的准确诊断具有重要的现实意义。现时，国际上通常用来筛查肝癌的生物标志物是血清AFP(甲胎蛋白)。但其敏感性只有39％至65％，特异性只有76％至94％。由于其检测肝癌的敏感性跟特异性不甚理想，因此美国的治疗指南不推荐血清AFP用于肝癌的诊断。中国跟欧洲的治疗指南都指出，正常个体的AFP水平应小于20ng/ml，大于400ng/ml则可提示肝癌的诊断。而20至400ng/ml则是诊断的“灰色地带”。因此利用AFP筛查肝癌容易导致误诊漏诊。除了血液取样方式，另一种诊断方式是组织取样诊断。然而，肝组织取样对人体破坏性强，因此，亟须一种没有创伤式而准确的诊断方法。人体唾液腺中存在许多毛细血管网，因此，唾液是血液循环的末端产物。血液中存在的分子物质，例如DNA、RNA、蛋白、药物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。美国的食品及药物管理局(FDA)已经批准了利用唾液检测药物滥用、HIV感染、激素水平、中毒等试剂在市场上应用，现已在全美都已经得到普及。在临床中，于唾液中寻找分子标记物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。研究已经证实了唾液中的转录物、蛋白、代谢物和其他分子物质能检测出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥综合征等其他口腔或者系统性疾病。体内的微小RNA(microRNA，miRNA)与包括肝癌在内的多种癌症的发病与发展密切相关。研究发现多种miRNA在肝癌组织中表达失调，组织中表达失调的miRNA可作为生物标记物对肝癌有较佳的诊断价值。但miR-664a-5p是否可作为生物标记物协助诊断肝癌，目前尚无报道。唾液中的miR-664a-5p是否可作为生物标记物协助诊断肝癌，更无报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供miR-664a-5p在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用。本专利技术的目的还在于同时提供了一种肝癌诊断的试剂/试剂盒。本专利技术的上述目的通过以下技术手段实现：miR-664a-5p为近2年来新发现的miRNA。编码的基因位于人类第1号染色体上GRCh38基因组的第220200538至220200619碱基序列上。总长度为24bp。无突变的miR-664a-5p序列如：SEQIDNO：1ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU一方面，本专利技术提供了miR-664a-5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用；优选地，所述的miR-664a-5p的序列如SEQIDNO：1所示。一方面，本专利技术提供了miR-664a-5p在筛选抗肝癌药物中的应用；一方面，本专利技术提供了一组miRNA引物，所述miRNA引物为miR-664a-5p的反转录引物，包括SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物对。一方面，本专利技术提供了上述的引物在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用。另一方面，本专利技术提供一种肝癌诊断试剂/试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂/试剂盒含有检测样本中miR-664a-5p表达量的试剂。本专利技术中，所述的试剂/试剂盒检测的样本为组织、血液、唾液；优选地，为唾液。因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。所述的检测样本中miR-664a-5p表达量为通过qPCR、基因微阵列对miR-664a-5p进行定量分析；作为优选的实施方式，采用qPCR对miR-664a-5p进行定量分析。所述的试剂/试剂盒的检测结果为：当样本中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，肝癌阳性，当样本中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，肝癌阴性；更优选地，当唾液中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，肝癌阳性；当唾液中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，肝癌阴性。所述的miR-664a-5p的表达量是通过qPCR相对表达量法测定的，其中内参snU6。所述的试剂/试剂盒含有miR-664a-5p的逆转录扩增引物，用于检测miR-664a-5p的表达量。作为一种实施方式，所述的扩增引物如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示，通过qPCR检测miR-664a-5p的表达量。进一步地，所述的试剂/试剂盒还含有蛋白酶；优选地，所述的蛋白酶为蛋白酶K；进一步地，所述的试剂/试剂盒还含有酸酚氯仿混合物；优选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；更优选地；苯酚与氯仿的体积比为4.5-5.5:1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7；进一步地，所述的试剂/试剂盒还含有RNA酶抑制剂；优选地，所述的RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)。作为一种试剂/试剂盒的使用方法：其包括提取唾液中总RNA后，进行miR-664a-5p的逆转录，再通过qPCR反应检测miR-664a-5p水平。提取唾液miR-664a-5p的方法可采用以下步骤：S1.取唾液样本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；S2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g离心4-6分钟，收集上清；S3.加入1.2-1.4倍体积的乙醇，再经5000-6000g离心20-60秒过滤离心，弃滤液；S4.加入预热的RNA抑制酶水，10000-12000g离心20-60秒，收集RNA。另一方面，本专利技术还提供了一种检测肝癌的芯片，特征在于，所述的芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的生物标志物miR-664a-5p的探针。所述的miR-664a-5p的序列如SEQIDNO：1所示。另一方面，本专利技术还提供了一种肝癌诊断系统：其特征在于，所述的检测系统含有：a)检测构件：所述的检测构件用以检测待测样本中miR-664a-5p的表达量；b)结果判断构件：所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的miR-664a-5p的表达量得出肝癌的患病风险高低或是患病风险值；所述的样本为组织、血液、唾液；更优选地，为唾液；所述的检测构件为qPCR构件、基因微阵列构件；更优选地，为qPCR构件；所述的结果判断构件为软件，其含有输入模块、分析模块和输出模块；输入模块用于输入miR-664a-5p的表达量；分析模块用于根据miR-664a-5p的表达量，分析出肝癌的患病风险高低或是患病风险值；输出模块用于输出分析模块的分析结果；所述的诊断系统中，当样本中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，诊断结果为肝癌阳性，当样本中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，诊断结果为肝癌阴性；更优选地，当唾液中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，诊断结果肝癌阳性；当唾液中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，诊断结果肝癌阴性；所述的miR-664a-5p的表达量是通过qPCR相对表达量法测定的，其中内参为snU6。本专利技术的一大突破在于，发现在肝癌患者的本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR‑664a‑5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.miR-664a-5p的检测试剂在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miR-664a-5p的序列如SEQIDNO：1所示。3.miR-664a-5p在筛选抗肝癌药物中的应用；优选地，所述的miR-664a-5p的序列如SEQIDNO：1所示。4.一组miRNA引物，所述miRNA引物为miR-664a-5p的反转录引物，包括SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物对。5.权利要求4所述的引物在制备肝癌诊断试剂/试剂盒中的应用。6.一种肝癌诊断试剂/试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂/试剂盒含有检测样本中miR-664a-5p表达量的试剂；优选地，所述的miR-664a-5p的序列如SEQIDNO：1所示；优选地，所述的样本为组织、血液、唾液；更优选地，为唾液；优选地，所述的检测样本中miR-664a-5p表达量为通过qPCR、基因微阵列对miR-664a-5p进行定量分析；更优选地，通过qPCR对miR-664a-5p进行定量分析；优选地，所述的试剂/试剂盒的检测结果为：当样本中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，肝癌阳性，当样本中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，肝癌阴性；更优选地，当唾液中的miR-664a-5p的表达量大于1.46时，肝癌阳性；当唾液中的miR-664a-5p的表达量小于1.46时，肝癌阴性；其中，所述的miR-664a-5p的表达量是通过qPCR相对表达量法测定的，其中内参为snU6。7.根据权利要求6所述的肝癌诊断试剂/试剂盒，其特征在于，含有miR-664a-5p的扩增引物；优选地，所述的扩增引物为用于qPCR反应；优选地，所述的扩增引物如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。8.根据权利要求7所述的肝癌诊断试剂/试剂盒，其特征在于，还含有蛋白酶；优选地，所述的蛋白酶为蛋白酶K；优选地，还含有酸酚氯仿混合物；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；更优选地；苯酚与氯仿的体积比为4.5-5.5:1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7；优选地，还含有RNA酶抑制剂；更优选地，所述的RNA酶抑制剂为焦碳酸二乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴斌，谢子钧，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东,44