一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法技术

本发明专利技术提出一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法，采用淀粉凝固体制备、覆膜、毒素收集、酶解、离心、镍柱层析、超滤除杂的方法，获得箱形水母蛋白类毒素粗纯液。与现有技术相比，本发明专利技术的有益效果是：操作时，操作人员不直接接触箱形水母，保证人员安全；只对箱形水母刺丝囊及其毒性物质进行采集，对水母损害小，其再生时间短，仅需2天，生产可持续性极具优势，为未来工业化利用水母毒素提供了条件；使用酶法分解淀粉凝固体时间较水母自溶时间更短，利于缩短生产时间；收集的刺丝囊及其毒素，受外界蛋白污染可能性小，初步纯化分离出的蛋白仅为水母毒素蛋白，为后续进一步纯化创造良好的基础。

A crude method for in vivo box jellyfish protein toxoid

The invention provides a method of pure crude protein in the box jellyfish toxins, using the method of starch gel solid preparation, coating, toxin collection, enzymatic hydrolysis, centrifugation, nickel column chromatography, ultra filter, get the box jellyfish protein toxin purified liquid. Compared with the prior art, the invention has the beneficial effects: when operating, the operator does not directly contact the box jellyfish, ensure the safety of personnel; only to collect the capsule and toxic substances on the box jellyfish jellyfish wire, small damage, the regeneration time is short, only 2 days, the production can be very persistent advantage, provide conditions for the future of industrialization by using the enzymatic decomposition of jellyfish toxins; starch coagulation time is jellyfish autolysis time shorter, to shorten the production time; nematocyst and toxin collection, outside protein contamination, preliminary purification of isolated protein was only jellyfish toxins, create a good foundation for the further purification of the follow-up.

【技术实现步骤摘要】
一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法
本专利技术属于海洋生物
，具体涉及一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法。
技术介绍
箱形水母（Chironexfleckeri）属腔肠动物门、钵水母纲、立方水母目、箱形水母科。箱形水母是一种淡蓝色的透明水母，形状像个箱子，有4个明显的侧面，有数十根触须，每条触须上布满了储存毒液的刺细胞，是世界上毒性最强的水母，根据美国国家科学基金会提供的数据，单是在菲律宾，每年就有20～40人死于箱形水母的毒刺。箱形水母毒素具有溶血活性、神经毒性、皮肤肌肉毒性，是极具潜力的海洋药物开发资源，但由于其巨大的毒性，为进一步研究及未来生产带来困难，如何安全获得其毒素也是各国科学家研究的重点之一。目前获得水母毒素的方法主要是用自动降解法来分离刺丝囊，将水母触角在4℃下，一定量的海水或NaCl溶液中放置1～4天，等待水母自动降解后，采用离心法回收得到小球状的刺丝囊，此法得到的刺丝囊细胞最纯净，活性最好，中国专利申请号201010149779.5名称为一种水母毒素去溶血毒性的方法，即采用此方法获得水母粗毒提取液。但此法具有较多缺点，如水母触角只能一次性利用，不能循环持续使用，即便水母触手可以再生，也需7-10天才能再生完成，耗时较长，不利于工业化水母毒素采集的实现。而水母在有触手的情况下，再生刺丝囊仅需2天时间，如果能单独采集刺丝囊，不损伤水母触手，那将缩短采集周期，有利于实现连续化、工业化生产，本专利技术正是为实现这一目的而产生。
技术实现思路
本专利技术提供一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术公开的技术方案特征包含如下步骤：a)淀粉凝固体制备：淀粉20～30%（w/w），增稠剂0～20%（w/w），纯化水补齐至100%（w/w），加热煮沸，期间不停搅拌，待无沉淀时，停止加热，入模（模底铺设尼龙纱网）晾至室温，即为淀粉凝固体；b)覆网：在淀粉凝固体未完全凝固时，外测使用尼龙纱网固定，以增加淀粉凝固体的抗破损性能；c)毒素收集：使用覆网淀粉凝固体模仿水母食物，接近箱形水母，诱导水母对其进行防御和捕猎，等待一段时间后回收覆网淀粉凝固体；d)酶解：对回收的覆网淀粉凝固体进行解剖，取外层厚度1～5mm淀粉凝固体压碎，使用组氨酸修饰的淀粉酶，于20～35℃进行酶解，加入一定量的纯化水，酶解至无大块淀粉固体残留时停止，获得酶解液；e)离心：保持4℃，对酶解液进行离心，以除去未酶解的残渣，保留离心上清液；f)镍柱层析：保持4℃，将上清液进行循环上样于镍柱层析柱，保留最终的滤出液，除去淀粉酶，最后洗脱层析柱回收淀粉酶；g)超滤除杂：保持4℃，使用截留量为1kD的水性膜对步骤f）中的滤出液进行超滤，除去盐、葡萄糖等小分子杂质，并对水母毒素进行浓缩，保留超滤液即为水母毒素粗纯液。所述的淀粉包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉。所述的增稠剂包括但不限于黄原胶、卡拉胶、明胶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：只对箱形水母刺丝囊及其毒性物质进行采集，对水母损害小，其再生时间短，仅需2天，生产可持续性极具优势，为未来工业化利用水母毒素提供了条件；使用酶法分解淀粉凝固体时间较水母自溶时间更短，利于缩短生产时间；收集的刺丝囊及其毒素，受外界蛋白污染可能性小，初步纯化分离出的蛋白仅为水母毒素蛋白，为后续进一步纯化创造良好的基础。具体实施方式实施例1：将玉米淀粉25g、黄原胶3g、纯化水72g加入不锈钢锅中加热煮沸，不停搅拌至无沉淀后，倒入长20cm，宽12cm，深2cm的不锈钢方槽中冷却凝固，方槽中铺上已洗净网孔孔径为2mm的尼龙纱网，未凝固完全时，再覆盖上一层尼龙纱网，凝固后，小心脱模。将覆网淀粉凝固体固定在不锈钢或塑料延长棍上，接近自然水域中或人工养殖的活体箱形水母8只，轻微搅动，诱导水母对其进行防御行为，每只收集10min后，回收覆网淀粉凝固体，用纯化水稍冲洗，小心撕取下尼龙网，将两面5mm厚度的淀粉凝固体用不锈钢刀切下，使用不锈钢板将其压碎完全，加入200ml纯化水，加入组氨酸修饰的α-淀粉酶10000U，设置温度25℃，酶解5h，无大块淀粉固体残留，4℃离心，保留上清液，向上清液中加入Tris-HCl，使终浓度为20mmol/L，加入NaCl，使终浓度为5mol/L，使用金属镍亲和层析法进行纯化，流速1ml/min，重复过柱一次，以除去淀粉酶。于4℃对回收的过柱液进行超滤浓缩，以除去淀粉酶水解出的单糖及多糖以及缓冲液中的盐，使用截留量为1kD的水性纤维素膜，向超滤液中加入纯化水1L，浓缩至体积为50ml时停止浓缩，即为水母毒素粗纯液。实施例2：将土豆淀粉26g、卡拉胶2g、纯化水72g加入不锈钢锅中加热煮沸，不停搅拌至无沉淀后，倒入长20cm，宽12cm，深2cm的不锈钢方槽中冷却凝固，方槽中铺上已洗净网孔孔径为2mm的尼龙纱网，未凝固完全时，再覆盖上一层尼龙纱网，凝固后，小心脱模。将覆网淀粉凝固体固定在不锈钢或塑料延长棍上，接近自然水域中或人工养殖的活体箱形水母6只，轻微搅动，诱导水母对其进行防御行为，每只收集10min后，回收覆网淀粉凝固体，用纯化水稍冲洗，小心撕取下尼龙网，将两面5mm厚度的淀粉凝固体用不锈钢刀切下，使用不锈钢板将其压碎完全，加入300ml纯化水，加入组氨酸修饰的α-淀粉酶10000U，设置温度25℃，酶解4h，无大块淀粉固体残留，4℃离心，保留上清液，向上清液中加入Tris-HCl，使终浓度为20mmol/L，加入NaCl，使终浓度为5mol/L，使用金属镍亲和层析法进行纯化，流速1ml/min，重复过柱一次，以除去淀粉酶。于4℃对回收的过柱液进行超滤浓缩，以除去淀粉酶水解出的单糖及多糖以及缓冲液中的盐，使用截留量为1kD的水性纤维素膜，向超滤液中加入纯化水1L，浓缩至体积为50ml时停止浓缩，即为水母毒素粗纯液。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法，其特征如下：a)淀粉凝固体制备：淀粉20～30%（w/w），增稠剂0～20%（w/w），纯化水补齐至100%（w/w），加热煮沸，期间不停搅拌，待无沉淀时，停止加热，入模（模底铺设尼龙纱网）晾至室温，即为淀粉凝固体；b)覆网：在淀粉凝固体未完全凝固时，外测使用尼龙纱网固定，以增加淀粉凝固体的抗破损性能；c)毒素收集：使用覆网淀粉凝固体模仿水母食物，接近箱形水母，诱导水母对其进行防御和捕猎，等待一段时间后回收覆网淀粉凝固体；d)酶解：对回收的覆网淀粉凝固体进行解剖，取外层厚度1～5mm淀粉凝固体压碎，使用组氨酸修饰的淀粉酶，于20～35℃进行酶解，加入一定量的纯化水，酶解至无大块淀粉固体残留时停止，获得酶解液；e)离心：保持4℃，对酶解液进行离心，以除去未酶解的残渣，保留离心上清液；f)镍柱层析：保持4℃，将上清液进行循环上样于镍柱层析柱，保留最终的滤出液，除去淀粉酶，最后洗脱层析柱回收淀粉酶；g)超滤除杂：保持4℃，使用截留量为1kD的水性膜对步骤f）中的滤出液进行超滤，除去盐、葡萄糖等小分子杂质，并对水母毒素进行浓缩，保留超滤液即为水母毒素粗纯液。...

【技术特征摘要】
1.一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法，其特征如下：a)淀粉凝固体制备：淀粉20～30%（w/w），增稠剂0～20%（w/w），纯化水补齐至100%（w/w），加热煮沸，期间不停搅拌，待无沉淀时，停止加热，入模（模底铺设尼龙纱网）晾至室温，即为淀粉凝固体；b)覆网：在淀粉凝固体未完全凝固时，外测使用尼龙纱网固定，以增加淀粉凝固体的抗破损性能；c)毒素收集：使用覆网淀粉凝固体模仿水母食物，接近箱形水母，诱导水母对其进行防御和捕猎，等待一段时间后回收覆网淀粉凝固体；d)酶解：对回收的覆网淀粉凝固体进行解剖，取外层厚度1～5mm淀粉凝固体压碎，使用组氨酸修饰的淀粉酶，于20～35℃进行酶解，加入一定量的纯化水，酶解至无大...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘爱芹，
申请(专利权)人：熊廷珍，
类型：发明
国别省市：山东,37