来自样品背景的靶多核苷酸的纳米孔隙检测制造技术

本文公开了用于通过靶多核苷酸的扩增和在纳米孔隙装置中的检测来检测混合样品中的靶多核苷酸的方法和组合物。

Nano pore detection of target polynucleotide from sample background

Methods and compositions for detecting target polynucleotides in mixed samples by amplification of target polynucleotides and detection in a nanopore device are disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自样品背景的靶多核苷酸的纳米孔隙检测相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月2日提交的62/111,075号美国临时专利申请的优先权。其公开内容通过引用并入本文。
技术介绍
检测生物体基因组和其他生化机构的特定核酸序列或部分的核酸检测具有广泛的用途，其中包括病原体检测、遗传突变分析、疾病筛选和转基因筛选。核酸检测的一种方法是扩增一段DNA以产生多个扩增子(即DNA靶克隆)，以获得有关核酸靶标的存在和/或数量的信息。这可以被用于测定，例如，有机体(例如病毒)是否被视为存在、基因是否突变或者基因是否被表达。常见的核酸检测方法依赖于扩增的DNA的光学检测。当需要进行现场检测时，这可能会限制设备的便携性。此外，光学检测方法往往增加了仪器成本和复杂性。新兴技术通过使用电化学传感或纯电传感技术，简单得多的无化学检测方法，来改善这些问题。不幸的是，设备的高制造成本和低产量阻碍了这些技术在商业上的可行性。因此，所需要的是快速、简单和准确的，且不需要昂贵或耗时的光学或化学检测的用于靶多核苷酸序列的稳定检测的方法、装置和组合物。
技术实现思路
本文所公开的各个方面可以满足上述一个或多个需求。本文所描述的系统和方法各自具有几个方面，其中没有单一的一个方面单独地负责其所需的特性。非是限制通过以下权利要求表达的本公开的范围，现在将简要讨论一些更突出的特征。在考虑此论述后，和特别是在阅读标题为“具体实施方式”的部分后，将了解本文所描述的样本特征是如何提供改进的系统和方法的。在一些实施方式中，本文提供了用于电检测样品中目标分子或条件的存在或不存在的方法、组合物和装置。在一些实施方式中，本文提供了一种用于检测疑似存在于样品中的靶多核苷酸序列的存在或不存在的方法，所述方法包括：提供一组引物，其中所述引物中至少之一可与包含所述靶多核苷酸序列的多核苷酸杂交，和其中所述引物中至少一个被修饰以包含能够特异性结合有效载荷分子的偶联位点；对所述样品进行扩增反应，其中所述样品包含所述引物组和用于扩增的试剂，使得由所述扩增反应产生的包含所述靶多核苷酸序列的扩增子将包含所述偶联位点；将所述有效载荷分子结合到所述偶联位点；将所述样品加载到包含纳米孔隙的装置中(其中所述纳米孔隙将所述装置的内部空间分隔成两个容积)，并且将所述装置配置成使所述核酸通过一个或多个孔隙，其中所述装置包含用于每个孔隙的传感器，其被配置为识别穿过纳米孔隙的物体；以及通过使用来自所述传感器的数据测定与有效载荷分子结合的靶多核苷酸是否通过纳米孔隙来检测所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在或不存在。在一些实施方式中，在所述扩增之前将样品加载到所述装置中。在一些实施方式中，在所述扩增后将样品加载到所述装置中。在一些实施方式中，有效载荷分子在所述扩增后结合于所述扩增子的所述偶联位点。在一些实施方式中，有效载荷分子在所述扩增之前与所述引物的所述偶联位点结合。在一些实施方式中，样品在所述扩增和所述纳米孔隙中的检测之间不经历纯化步骤。在一些实施方式中，将所述样品以至少1:20000、1:10000、1:5000、1:2000、1:1000、1:500、1:200、1:100、1:50、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1或1:1.05的稀释被加载至所述纳米孔隙装置中。在一些实施方式中，所述样品未经稀释而被加载到所述纳米孔隙装置中。在一些实施方式中，样品包含非靶多核苷酸和扩增反应试剂。在一些实施方式中，纳米孔隙的直径为至少5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm。在一些实施方式中，扩增反应选自于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、连接反应介导的PCR、环介导的扩增(LAMP)、等温扩增、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切口酶扩增反应或重组聚合酶扩增。在一些实施方式中，在装置的内部空间中进行扩增反应。在一些实施方式中，靶多核苷酸包含双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、肽核酸(PNA)、单链核糖核酸(ssRNA)、DNA/RNA杂合体或双链核糖核酸(dsRNA)。在一些实施方式中，靶多核苷酸是天然存在的多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸是人工合成的多核苷酸。在一些实施方式中，靶多核苷酸是重组多核苷酸。在一些实施方式中，有效载荷分子选自于：树状聚合物、双链DNA、单链DNA、DNA适体、荧光团、蛋白质、抗体、多肽、纳米珠、纳米棒、纳米管、纳米颗粒、富勒烯、PEG分子、脂质体或胆固醇-DNA杂合体。在一些实施方式中，有效载荷分子包含电荷。在一些实施方式中，带电荷的有效载荷分子选自于：肽、氨基酸、带电纳米颗粒、合成分子、核苷酸、多核苷酸、金属或离子。在一些实施方式中，与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述带电的有效载荷分子结合时，检测靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。在一些实施方式中，与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述有效载荷分子结合时，检测靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。在一些实施方式中，传感器包含被配置为在所述两个容积之间施加电压差，并且测量通过该分隔两个容积的纳米孔隙的电流以产生电流事件特征(currenteventsignature)的电极对。在一些实施方式中，当所述有效载荷结合的靶多核苷酸通过纳米孔隙时产生的电流事件特征与背景分子的电流事件特征按照平均深度、最大深度、持续时间、深度级数、深度和持续时间的面积(areaofdepthandduration)或噪音水平是可区分的。在一些实施方式中，偶联位点和有效载荷分子通过共价键结合。在一些实施方式中，共价键通过点击化学(clickchemistry)形成。在一些实施方式中，点击化学是铜催化的。在一些实施方式中，点击化学是无铜的。在一些实施方式中，偶联位点和有效载荷分子通过非共价键结合。在一些实施方式中，该非共价键是氢键、离子键、范德华相互作用、疏水相互作用、极性键、阳离子-pi相互作用/平面堆叠相互作用或金属键。在一些实施方式中，偶联位点位于所述引物的3'或5'末端。在一些实施方式中，偶联位点位于所述扩增子的3'或5'端。在一些实施方式中，偶联位点包含化学基团、反应性基团、小分子或肽。在一些实施方式中，该小分子包含生物素。在一些实施方式中，该反应性基团包含二苯并环辛基(DBCO)或叠氮化物。在一些实施方式中，两个或更多个有效载荷分子与所述扩增子结合。在一些实施方式中，该装置至少包含两个串联的纳米孔隙，并且其中在转位过程中与所述有效载荷分子结合的所述扩增子同时处于所述至少两个纳米孔隙中。本文还提供了用于检测疑似存在于样品中的靶多核苷酸序列的存在或不存在的方法，所述方法包括：提供一组引物，其中所述引物中的至少一个可与包含所述靶多核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述引物中至少一个结合有效载荷分子；对所述样品进行扩增反应，其中所述样品包含所述引物组和用于扩增的试剂，使得其中由所述扩增反应产生的包含所述靶多核苷酸序列的扩增子将结合到所述有效载荷分子；将所述样品加载到包含纳米孔隙的装置中(其中所述纳米孔隙将所述装置的内部空间分隔成两个容积)，并且将所述装置配置成使所述核酸通过一个或多个孔隙，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测疑似存在于样品中的靶多核苷酸序列的存在或不存在的方法，其包括：提供一组引物，其中所述引物中的至少一个与包含所述靶多核苷酸序列的多核苷酸是可杂交的，并且其中所述引物中的至少一个被修饰为包含能够特异性结合有效载荷分子的偶联位点；对所述样品进行扩增反应，其中所述样品包含所述引物组和用于扩增的试剂，使得由所述扩增反应产生的包含所述靶多核苷酸序列的扩增子将包含所述偶联位点；将所述有效载荷分子结合到所述偶联位点；将所述样品加载到包含纳米孔隙的装置中，其中所述纳米孔隙将所述装置的内部空间分隔成两个容积；并且将所述装置配置成使所述核酸通过一个或多个孔隙，其中所述装置包含用于每个孔隙的传感器，其被配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体；和通过使用来自所述传感器的数据确定与所述有效载荷分子结合的所述靶多核苷酸是否穿过所述纳米孔隙来检测所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在或不存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.02 US 62/111,0751.一种用于检测疑似存在于样品中的靶多核苷酸序列的存在或不存在的方法，其包括：提供一组引物，其中所述引物中的至少一个与包含所述靶多核苷酸序列的多核苷酸是可杂交的，并且其中所述引物中的至少一个被修饰为包含能够特异性结合有效载荷分子的偶联位点；对所述样品进行扩增反应，其中所述样品包含所述引物组和用于扩增的试剂，使得由所述扩增反应产生的包含所述靶多核苷酸序列的扩增子将包含所述偶联位点；将所述有效载荷分子结合到所述偶联位点；将所述样品加载到包含纳米孔隙的装置中，其中所述纳米孔隙将所述装置的内部空间分隔成两个容积；并且将所述装置配置成使所述核酸通过一个或多个孔隙，其中所述装置包含用于每个孔隙的传感器，其被配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体；和通过使用来自所述传感器的数据确定与所述有效载荷分子结合的所述靶多核苷酸是否穿过所述纳米孔隙来检测所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在或不存在。2.如权利要求1的方法，其中在所述扩增之前将所述样品加载到所述装置中。3.如权利要求1的方法，其中在所述扩增之后将所述样品加载到所述装置中。4.如权利要求1的方法，其中在所述扩增后将所述有效载荷分子结合于所述扩增子的所述偶联位点。5.如权利要求1的方法，其中在所述扩增之前将所述有效载荷分子结合于所述引物的所述偶联位点。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品在所述扩增和所述在纳米孔隙中的检测之间不经历纯化步骤。7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品以至少1:20000、1:10000、1:5000、1:2000、1:1000、1:500、1:200、1:100、1:50、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1或1:1.05的稀释度被加载至所述纳米孔隙装置中。8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品未经稀释而加载到所述纳米孔隙装置中。9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品包含非靶多核苷酸和扩增反应试剂。10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纳米孔隙的直径为至少5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm。11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述扩增反应选自于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、连接反应介导的PCR、环介导的扩增(LAMP)、等温扩增、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切口酶扩增反应或重组聚合酶扩增。12.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述装置的内部空间中进行所述扩增反应。13.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、肽核酸(PNA)、单链核糖核酸(ssRNA)、DNA/RNA杂合体或双链核糖核酸(dsRNA)。14.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是天然存在的多核苷酸。15.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是人工合成的多核苷酸。16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是重组多核苷酸。17.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子选自于：树状聚合物、双链DNA、单链DNA、DNA适体、荧光团、蛋白质、抗体、多肽、纳米珠、纳米棒、纳米管、纳米颗粒、富勒烯、PEG分子、脂质体或胆固醇-DNA杂合体。18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子包含电荷。19.如权利要求18的方法，其中所述带电的有效载荷分子选自于：肽、氨基酸、带电纳米颗粒、合成分子、核苷酸、多核苷酸、金属或离子。20.如权利要求18的方法，其中与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述带电的有效载荷分子结合时，检测靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。21.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述有效载荷分子结合时，检测靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。22.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述传感器包含被配置为在所述两个容积之间施加电压差，并且测量通过分隔两个容积的该纳米孔隙的电流以产生电流事件特征的电极对。23.如权利要求22的方法，其中当所述有效载荷结合的靶多核苷酸穿过所述纳米孔隙时产生的电流事件特征与背景分子的电流事件特征按照其平均深度、最大深度、持续时间、深度级数、深度和持续时间的面积或噪音水平是可区分的。24.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述偶联位点和有效载荷分子通过共价键结合。25.如权利要求24的方法，其中通过点击化学形成所述共价键。26.如权利要求25的方法，其中所述点击化学是铜催化的。27.如权利要求25的方法，其中所述点击化学是无铜的。28.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述偶联位点和所述有效载荷分子通过非共价键结合。29.如权利要求28的方法，其中所述非共价键是氢键、离子键、范德华相互作用、疏水相互作用、极性键、阳离子-pi相互作用、平面堆叠相互作用或金属键。30.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述偶联位点位于所述引物的3'或5'末端。31.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述偶联位点位于所述扩增子的3'或5'末端。32.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述偶联位点包含化学基团、反应性基团、小分子或肽。33.如权利要求32的方法，其中所述小分子包含生物素。34.如权利要求32的方法，其中所述反应性基团包含二苯并环辛基(DBCO)或叠氮化物。35.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中两个或更多的有效载荷分子与所述扩增子结合。36.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述装置包含至少两个串联的纳米孔隙，并且其中在转位过程中与所述有效载荷分子结合的所述扩增子同时处于所述至少两个纳米孔隙中。37.一种用于检测疑似存在于样品中的靶多核苷酸序列的存在或不存在的方法，其包括：提供一组引物，其中所述引物中的至少一个与包含所述靶多核苷酸序列的多核苷酸是可杂交的，并且其中所述引物中的至少一个与有效载荷分子结合；对所述样品进行扩增反应，其中所述样品包含所述引物组和用于扩增的试剂，使得由所述扩增反应产生的包含所述靶多核苷酸序列的扩增子将结合于所述有效载荷分子；将所述样品加载到包含纳米孔隙的装置中，其中所述纳米孔隙将所述装置的内部空间分隔成两个容积；并且将所述装置配置成使所述核酸穿过一个或多个孔隙，其中所述装置包含用于每个孔隙的传感器，其被配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体；和通过使用来自所述传感器的数据确定与所述有效载荷分子结合的所述靶多核苷酸是否穿过所述纳米孔隙，来检测所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在或不存在。38.如权利要求37的方法，其中在所述扩增之前将所述样品加载到所述装置中。39.如权利要求37的方法，其中在所述扩增之后将所述样品加载到所述装置中。40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述样品在所述扩增和所述在纳米孔隙中的检测之间不经历纯化步骤。41.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述样品以至少1:10000、1:1000、1:500、1:200、1:100、1:50、1:20、1:10、1:5、1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1或1:1.05的稀释被加载至所述纳米孔隙装置中。42.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述样品未经稀释而加载到所述纳米孔隙装置中。43.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述样品包含非靶多核苷酸和扩增反应试剂。44.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述纳米孔隙的直径为至少5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm。45.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述扩增反应选自于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、连接反应介导的PCR、环介导的扩增(LAMP)、等温扩增、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增、链置换扩增、解旋酶依赖性扩增、切口酶扩增反应或重组聚合酶扩增。46.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中在所述装置的内部空间中进行所述扩增反应。47.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含双链脱氧核糖核酸(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、肽核酸(PNA)、单链核糖核酸(ssRNA)、DNA/RNA杂合体或双链核糖核酸(dsRNA)。48.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是天然存在的多核苷酸。49.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是人工合成的多核苷酸。50.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸是重组多核苷酸。51.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子选自于：树状聚合物、双链DNA、单链DNA、DNA适体、荧光团、蛋白质、抗体、多肽、纳米珠、纳米棒、纳米管、纳米颗粒、富勒烯、PEG分子、脂质体或胆固醇-DNA杂合体。52.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述有效载荷分子包含离子电荷。53.如权利要求52的方法，其中所述带电的有效载荷分子选自于：肽、氨基酸、带电纳米颗粒、合成分子、核苷酸、多核苷酸、金属或离子。54.如权利要求52的方法，其中与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述带电的有效载荷分子结合时，检测所述靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。55.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中与未结合的靶多核苷酸相比，当所述靶多核苷酸与所述有效载荷分子结合时，检测所述靶多核苷酸的存在或不存在的灵敏度或特异性增加。56.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述传感器包含被配置为在所述两个容积...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·J·莫林，T·施罗普施雷，W·B·邓巴，D·A·海勒，H·王，
申请(专利权)人：双孔人公司，
类型：发明
国别省市：美国,US