用于检测基因突变的方法和系统技术方案

提供了用于从组织样品(例如，保存的组织样品)检测基因突变的方法和系统。该方法包括以下步骤：a)从组织或生物样品中提取核酸；b)由提取的核酸制备靶核酸扩增子文库；c)对靶核酸扩增子文库测序以产生组织样品靶核酸序列数据；和d)分析样品靶核酸序列数据以确定其是否含有突变(例如，与特定疾病风险相关的突变)。本文描述的方法可以有利地在少于36小时内进行。

Method and system for detecting gene mutation

Methods and systems for detecting gene mutations from tissue samples (e.g., preserved tissue samples) are provided. The method comprises the following steps: a) from tissues or in biological samples by extraction of nucleic acid; b) for extraction of nucleic acid preparation of target nucleic acid amplicon library; c) to produce tissue samples of target nucleic acid sequence data of target nucleic acid amplicon sequencing; and D) to determine whether it contains a mutation analysis of samples of target nucleic acid sequence data (for example, with the specific risk of disease related mutations). The method described in this paper can be advantageously carried out in less than 36 hours.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测基因突变的方法和系统相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月26日提交的美国临时申请号62/056,314的根据35U.S.C.§119(e)的权益，出于所有目的将其通过引用全文并入本文。
本文提供了基因分析的方法和系统。更具体地，本文提供了使用组织样品检测基因突变的方法和系统。
技术介绍
最近，人类疾病的治疗策略症快速地进入个性化医疗，如对人类癌症的靶向治疗。例如，吉非替尼和埃罗替尼是良好使用的靶向肺癌患者中的EGFR突变的受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂。而且，具有EML4-ALK融合的肺癌患者对克唑替尼(一种MET-ALK抑制剂)有响应是已知的。市场上的或研发中的许多抗癌药物是靶向特异性药物。因此，通过使用更快和更稳健的技术加快临床标本的基因分析是非常重要的。福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织是临床基因分析中最常用的样品类型。来自FFPE组织的基因组DNA高度降解并且具有低质量是已知的。这限制了提取自FFPE组织的基因组DNA在临床基因分析中的应用。此外，通过商业可用的方法从FFPE标本提取DNA是昂贵和耗时的过程。通常，这些过程涉及有毒化学物质如苯酚或氯仿，其延误了患者样品的稳健性处理。因此，需要开发快速、简单、稳健和节省成本的方法，由FFPE样品制备基因组DNA用于基因分析。下一代测序(NGS)的出现已经改变了在许多医学领域和生命科学领域中基因和基因组研究的范例。NGS已经使人类、动物、微生物和农学基因组(agrogenomic)样品的测序应用革命化和最大化。之前的基因技术如桑格测序主要覆盖单个基因的小区域，而NGS测序可以覆盖全外显子组(基因组的所有外显子)，甚至覆盖全基因组。NGS应用的全基因组覆盖使得能够拓宽疾病的基因和基因组研究的范围。因为许多人类疾病如癌症主要是由在关键驱动子或主要途径调节因子中的基因改变的累积所导致的，高度期待的是使用NGS会发现新的治疗靶点和诊断标记物。已经有许多鉴定之前未报道的基因改变(例如，突变、多态性、扩增、染色体重排和基因融合)的NGS项目，所述基因改变可以用于人类疾病如癌症的治疗靶点或诊断标记物。虽然全基因组或外显子组测序仍然广泛地用于许多研究，但NGS的趋势目前正快速移向靶向测序。聚焦于小但是重要的基因集或基因区的靶向测序是筛选疾病相关的关键基因的非常有效的方法。目前，用于患者(例如，癌症患者)筛选的大多数NGS应用是通过靶向NGS而不是外显子组或全基因组测序来进行的。成本和实验时间的快速降低和靶向测序的可用性促进了NGS用于许多基因应用的用途。虽然NGS是有前途的并且在许多生命科学应用中变得更加流行，数种因素如复杂的样品制备、高成本和耗时的数据分析阻止其应用在临床和研究环境中更常规地使用。因此，改善当前的方法或开发更快、更稳健和精确的NGS应用的新方法是关键的。此外，在使用NGS中，NGS数据分析也呈现了障碍。因此，需要开发使NGS应用在许多生物领域和临床领域中更普遍和必要的新的、容易的且稳健的NGS数据分析工具。虽然靶向测序在人类疾病的基因测序中正在变得更具优势和更流行，但是数据分析主要由针对全外显子组或基因组测序而开发的程序或算法执行。因此，开发稳健的靶向测序分析工具对于许多靶向测序的应用(例如，癌症诊断、个性化医疗和产前筛选)将是非常重要的。
技术实现思路
本文提供了用于确定来自组织样品(例如保存的组织样品)的靶核酸中存在突变(例如于疾病风险相关的突变)的方法和系统。在第一个方面，本文提供了用于从保存的组织样品中提取核酸的方法。所述方法包括以下步骤：a)温育保存的组织样品与组织消化溶液以形成组织消化混合物；b)在80～110℃下加热组织消化混合物1～30分钟；c)将包含蛋白酶(proteinase)的蛋白酶(protease)溶液添加至组织消化混合物中以形成蛋白降解混合物；d)在50～70℃下温育蛋白降解混合物1～30分钟；和e)在80～110℃下温育蛋白降解混合物1～30分钟；由此，从保存的组织样品中提取核酸。在一些实施方式中，组织消化溶液选自i)组织消化溶液，其包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4以及吐温20；ii)组织消化溶液，其包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4以及Triton-X100；iii)组织消化溶液，其包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4以及浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4；iv)组织消化溶液，其包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT以及浓度为0.2mM～200mM的KCl；v)组织消化溶液，其包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液；vi)组织消化溶液，其包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液以及Triton-X100；vii)组织消化溶液，其包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液以及吐温20；viii)组织消化溶液，其包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl以及Triton-X100；ix)组织消化溶液，其包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl以及吐温20；和x)组织消化溶液，其包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.2mM～200mM的KCl、浓度为0.1mM～1mM的β-巯基乙醇以及TritonX-100。在某些实施方式中，蛋白酶溶液选自由以下组成的组：a)蛋白酶溶液，其包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K、浓度为1mM～50mM的Tris-HCl以及浓度为0.1～10mM的EDTA；b)蛋白酶溶液，其包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K；c)蛋白酶溶液，其包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K以及浓度为1mM～50mM的Tris-HCl；d)蛋白酶溶液，其包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K以及浓度为0.1mM～10mM的EDTA；e)蛋白酶溶液，其包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K、浓度为0.2mM～50mM的Tris-HCl、浓度为0.1mM～10mM的CaCl2以及浓度为20％～70％的甘油。在一些实施方式中，加热(b)是在99℃下进行5～30分钟。在某些实施方式中，温育蛋白降解混合物(c)是在60℃下进行5～30分钟。在一些实施方式中，温育蛋白降解混合物(d)是在99℃下进行5～30分钟。在另一个方面，本文提供了由组织样品制备靶核酸扩增子文库的方法，所述方法包括以下步骤：a)扩增从组织样品中提取的核酸，扩增步骤使用靶向感兴趣的核酸的5’磷酸化寡核苷酸；和b)将包括衔接头核酸和条形码核酸的寡核苷酸直接连接于每种扩增的靶核酸，由此制备靶核酸扩增子文库。在某些实施方式中，所述方法进一步包括在直接连接寡核苷酸(b)之前纯化扩增的靶核酸(a)的步骤。在另一个方面，本文提供了检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从保存的组织样品中提取核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)温育所述保存的组织样品与组织消化溶液以形成组织消化混合物，其中，所述组织消化溶液选自由以下组成的组：(i)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4和吐温20；(ii)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4和Triton‑X100；(iii)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4和浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4；(iv)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT和浓度为0.2mM～200mM的KCl；(v)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液；(vi)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液和Triton‑X100；(vii)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液和吐温20；(viii)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl和Triton‑X100；(ix)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl和吐温20；和(x)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.2mM～200mM的KCl、浓度为0.1mM～1mM的β‑巯基乙醇和Triton‑X100，(b)在80～110℃下加热所述组织消化混合物1～30分钟；(c)将包含蛋白酶的蛋白酶溶液添加至所述组织消化混合物中以形成蛋白降解混合物，以及在50～70℃下温育所述蛋白降解混合物1～30分钟；和(d)在80～110℃下温育所述蛋白降解混合物1～30分钟；由此，从所述保存的组织样品中提取核酸。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.26 US 62/056,3141.一种用于从保存的组织样品中提取核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)温育所述保存的组织样品与组织消化溶液以形成组织消化混合物，其中，所述组织消化溶液选自由以下组成的组：(i)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4和吐温20；(ii)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4、浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4和Triton-X100；(iii)组织消化溶液，包含浓度为10mM～140mM的NaCl、浓度为0.5mM～10mM的Na2HPO4和浓度为0.1mM～5mM的KH2PO4；(iv)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT和浓度为0.2mM～200mM的KCl；(v)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液；(vi)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液和Triton-X100；(vii)组织消化溶液，包含浓度为1mM～100mM的HEPES缓冲液和吐温20；(viii)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl和Triton-X100；(ix)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.05mM～5mM的DTT、浓度为0.2mM～200mM的KCl和吐温20；和(x)组织消化溶液，包含浓度为0.5mM～25mM的TAPS钠盐、浓度为0.2mM～200mM的KCl、浓度为0.1mM～1mM的β-巯基乙醇和Triton-X100，(b)在80～110℃下加热所述组织消化混合物1～30分钟；(c)将包含蛋白酶的蛋白酶溶液添加至所述组织消化混合物中以形成蛋白降解混合物，以及在50～70℃下温育所述蛋白降解混合物1～30分钟；和(d)在80～110℃下温育所述蛋白降解混合物1～30分钟；由此，从所述保存的组织样品中提取核酸。2.权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白酶溶液选自由以下组成的组：(a)蛋白酶溶液，包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K、浓度为1mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)和浓度为0.1～10mM的EDTA；(b)蛋白酶溶液，包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K和浓度为1mM～50mM的Tris-HCl(pH8.0)；(c)蛋白酶溶液，包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K和浓度为0.1mm～10mM的EDTA(d)蛋白酶溶液，包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K；和(e)蛋白酶溶液，包含浓度为5mg/ml～60mg/ml的蛋白酶K、浓度为0.2mMto50mM的Tris-HCl(pH8.0)、浓度为0.1mM～10mM的CaCl2和浓度为20％～70％的甘油。3.权利要求1所述的方法，其中，所述加热(b)是在99℃下进行5分钟。4.权利要求1所述的方法，其中，所述温育所述蛋白降解混合物(c)是在60℃下进行5分钟。5.权利要求1所述的方法，其中，所述温育所述蛋白降解混合物(d)是在99℃下进行5分钟。6.一种用于由组织样品制备靶核酸扩增子文库的方法，所述方法包括以下步骤：(a)扩增从组织样品中提取的核酸，扩增步骤使用靶向感兴趣的核酸的5’磷酸化寡核苷酸；和(b)将包括衔接头核酸和条形码核酸的寡核苷酸直接连接于每种扩增的靶核酸，由此制备靶核酸扩增子文库。7.权利要求6所述的方法，其进一步包括在直接连接寡核苷酸(b)之前纯化(a)的扩增的靶核酸的步骤。8.一种检测组织样品靶核酸序列中的突变而无需预处理序列数据的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得组织样品靶核酸序列数据和数据库靶核酸序列数据，其中，所述数据库靶核酸序列数据位于突变数据库中；(b)比较所述组织样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：金日镇，戴维·雅布隆斯，佩德罗·胡安·门德斯·罗梅罗，尹俊熙，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US