载脂蛋白C3(APOC3)iRNA组合物及其使用方法技术

本发明专利技术涉及靶向载脂蛋白C3(APOC3)基因的RNAi试剂例如双链RNAi试剂，和使用这类RNAi试剂来抑制APOC3表达的方法以及治疗患有APOC3相关障碍例如高甘油三酯血症的受试者的方法。

Apolipoprotein C3 (APOC3) iRNA composition and its use method

The present invention relates to targeting apolipoprotein C3 (APOC3) RNAi KIT gene such as double stranded RNAi reagent, RNAi reagent method and use this kind of method to inhibit the expression of APOC3 and treatment with APOC3 related disorders such as hypertriglyceridemia subjects.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】载脂蛋白C3(APOC3)iRNA组合物及其使用方法相关申请本申请要求2014年11月17日提交的美国临时申请号62/080,941和2015年3月20日提交的美国临时申请号62/136,159的优先权权益。前述申请的每个的全部内容特此通过引用结合在此。序列表本申请包含已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合的序列表。创建于2015年11月17日的所述ASCII副本被命名为121301-02520_SL.txt并且大小为212,085个字节。专利技术背景载脂蛋白C3(APOC3)是一种极低密度脂蛋白(VLDL)，并且是脂蛋白代谢的重要调节剂。在人类中，APOC2由位于基因簇中的APOC3基因与位于染色体11的长臂上的APOA1和APOA4基因共同编码。APOC3作为小的99个氨基酸的蛋白质在肝脏中表达，并在较小程度上在肠中表达。在除去内质网中的20个氨基酸的信号肽后，形成了79个氨基酸的成熟ApoC3蛋白，其可以以非糖基化或糖基化的同种型存在。APOC3的主要作用是通过非竞争性抑制内皮结合脂蛋白脂肪酶(LPL)来调节脂类分解。LPL水解富含三酰甘油(甘油三脂)的脂蛋白(TRL)中的三酰甘油，将脂肪酸释放到血浆中，并将大的富含三酰甘油的颗粒转化为较小的缺乏三酰基甘油的残留脂蛋白。缺乏APOC3的个体具有较低的TRL水平，加上三酰甘油的高效脂解作用。此外，其中APOC3基因已被遗传缺失的小鼠也显示具有低血浆三酰甘油水平和有效的TRL分解代谢。APOC3还抑制肝脂酶(HL)，肝脂酶是一种在肝脏中合成的具有甘油三酯脂肪酶和磷脂酶A1活性的脂肪分解酶。APOC3对HL的抑制作用进一步降低了肝脏中TRL残留物的脂类分解和摄取。APOC3还显示出刺激极低密度脂蛋白(VLDL)的合成。据信与APOC3的这种作用相关的潜在机制可能涉及APOB的蛋白酶体介导的降解的抑制，从而导致APOB合成和分泌增加，以及VLDL三酰甘油的合成增加。因此，APOC3可能在调节肝脏VLDL输出方面发挥关键作用。细胞研究报道APOC3可能干扰TRL和与肝脂蛋白受体的残留结合。APOC3可以通过掩蔽或改变APOB和APOE的构象来消除APOB和ApoE介导的脂蛋白与低密度脂蛋白受体(LDLR)的结合。APOC3还显著抑制乳糜微粒和VLDL颗粒与脂解作用刺激受体(LSR)的结合。APOC3水平的增加引起高甘油三酯血症或甘油三酯的高(高)血浓度(血症)的发展。甘油三酯水平升高与多种疾病有关，这些疾病包括心血管疾病、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、多囊卵巢综合征、肾脏疾病、肥胖症、2型糖尿病(胰岛素抵抗)、高血压和皮肤损害(黄色瘤)。非常高的甘油三酯水平也会增加急性胰腺炎的风险。因此，调节APOC3代谢可能是管理高甘油三酯血症和相关疾病的新型重要治疗方法。因此，本领域需要用于治疗载脂蛋白C3相关障碍如高甘油三酯血症的APOC3表达调节剂。专利技术概述本专利技术提供抑制或减少APOC3基因表达的iRNA组合物。该基因可以在细胞(例如受试者(例如人)体内的细胞)的内部。本专利技术还提供了用于治疗患有将受益于抑制或降低APOC3基因的表达的障碍(例如载脂蛋白C3相关疾病如高甘油三酯血症)的受试者的方法和疗法，该方法和疗法使用抑制或降低APOC3基因表达的iRNA组合物。在一些实施例中，本专利技术提供一种用于抑制载脂蛋白C3(APOC3)在细胞中表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含与SEQIDNO:1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQIDNO:2的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中至少一条链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，并且其中所述有义链与附接在3’-末端处的配体共轭。在某些方面中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。在一个方面中，该有义链和该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表4A、表4B、表5、表8、表9、表10、表11A、表11B、表12以及表13中列出的序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，修饰的核苷酸中的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟代修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯、非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物的核苷酸、包含乙烯基磷酸酯的核苷酸、包含腺苷-乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-异构体的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧胸苷-3’磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯的核苷酸、和与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。在一个实施例中，该有义链的基本上所有核苷酸都是修饰的。在另一方面，该反义链的基本上所有核苷酸都是修饰的。在又另一个实施例中，该有义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸均是修饰的核苷酸。在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸都是修饰的核苷酸。在另一个实施例中，该反义链的所有核苷酸都是修饰的核苷酸。在又另一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。在一个方面中，至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。在另一个方面中，至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3’突出端。在一些实施例中，本专利技术提供了一种能够抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该反义链包含与编码APOC3的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由化学式(III)表示：有义链：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’反义链：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’(III)其中：i、j、k和l各自独立地是0或1；p、p’、q和q’各自独立地是0-6；各Na和Na’独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；各Nb和Nb’独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；各np、np’、nq、以及nq’独立地表示一个突出端核苷酸，该np、np’、nq、以及nq’中的每一个可以或可以不存在；XXX、YYY、ZZZ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQ ID NO：2的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中至少一条链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，并且其中所述有义链被共轭到在3’‑末端处附接的一个配体上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.17 US 62/080,941;2015.03.20 US 62/136,1591.一种用于抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含与SEQIDNO：1的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQIDNO：2的核苷酸序列相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中至少一条链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，并且其中所述有义链被共轭到在3’-末端处附接的一个配体上。2.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链和所述反义链包含一个互补区，该互补区包含与表4A、表4B、表5、表8、表9、表10、表11A、表11B以及表12、表13中列出的序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。3.如权利要求1或2所述的双链RNAi试剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟代修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、包含氨基磷酸酯、非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1，5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物的核苷酸、包含乙烯基磷酸酯的核苷酸、包含腺苷-乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-异构体的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧胸苷-3’磷酸酯的核苷酸、包含2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯的核苷酸、和与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。4.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的基本上所有这些核苷酸均是修饰的。5.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述反义链的基本上所有这些核苷酸均是修饰的。6.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的基本上所有这些核苷酸和所述反义链的基本上这些核苷酸均是修饰的核苷酸。7.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸均是修饰的核苷酸。8.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述反义链的所有这些核苷酸均是修饰的核苷酸。9.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均是修饰的核苷酸。10.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3’突出端。11.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3’突出端。12.一种能够抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述反义链包含与编码APOC3的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由化学式(III)表示：有义链：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’反义链：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)1-Na’-nq’5’(III)其中：i、j、k和l各自独立地是0或1；p、p’、q和q’各自独立地是0-6；各Na和Na’独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；各Nb和Nb’独立地表示包含0-10个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸或者是修饰的或者是未修饰的或者是其组合；各np、np’、nq、以及nq’独立地表示一个突出端核苷酸，该np、np’、nq、以及nq’中的每一个可以或可以不存在；XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、以及Z’Z’Z’各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb’上的修饰不同于Y’上的修饰；并且其中该有义链被共轭到至少一个配体上。13.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中i是0；j是0；i是1；j是1；i和j两者均是0；或i和j两者均是1。14.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中k是0；l是0；k是1；l是1；k和l两者均是0；或k和l两者均是1。15.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。16.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中该Y’Y’Y’基序出现在该反义链的从5’-端起的11、12以及13位置处。17.如权利要求16所述的双链RNAi试剂，其中该Y’是2’-O-甲基或2’-氟代。18.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中化学式(III)由化学式(IIIa)表示：有义链：5’np-Na-YYY-Na-nq3’反义链：3’np’-Na，-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’(IIIa)。19.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是15-30个核苷酸对。20.如权利要求19所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-23个核苷酸对。21.如权利要求19所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-25个核苷酸对。22.如权利要求19所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是23-27个核苷酸对。23.如权利要求19所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是19-21个核苷酸对。24.如权利要求19所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是21-23个核苷酸对。25.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有15-30个核苷酸。26.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有19-30个核苷酸。27.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰选自下组，该组由以下各项组成：如表5、表9、表10、表11B、表12、和表13及其组合中列出的修饰。28.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰是2’-O-甲基和2’-氟代修饰。29.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。30.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中该配体是31.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中该配体被附接到该有义链的3’端上。32.如权利要求31所述的双链RNAi试剂，其中该RNAi试剂被共轭到如以下示意图中所示的该配体上其中X是O或S。33.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。34.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的3’-末端处。35.如权利要求34所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。36.如权利要求34所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。37.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5’-末端处。38.如权利要求37所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。39.如权利要求37所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。40.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5’-末端和3’-末端这两者处。41.如权利要求40所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。42.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。43.如权利要求42所述的双链RNAi试剂，其中该反义链包含在该5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在该3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且该有义链包含在该5’-末端抑或该3’-末端处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。44.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中在该双链体的该反义链的5’-端的1位置处的碱基对是一个AU碱基对。45.如权利要求9所述的双链RNAi试剂，其中这些Y核苷酸含有一个2’-氟代修饰。46.如权利要求12所述的双链RNAi试剂，其中这些Y’核苷酸含有一个2’-O-甲基修饰。47.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中该有义链具有总计21个核苷酸，并且该反义链具有总计23个核苷酸。48.如权利要求1或12所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂选自下组，该组具有在表4A、表4B、表5、表8、表9、表11A、表11B、表12以及表13中的任一个中列出的RNAi试剂。49.一种能够抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含5’-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU-3’(SEQIDNO：13)，并且所述反义链包含5’-AGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA-3’(SEQIDNO：14)，其中所述有义链的基本上所有这些核苷酸和所述反义链的基本上所有这些核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述有义链被共轭到在3’-末端处附接的一个配体上，并且其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。50.一种能够抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含5’-GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU-3’(SEQIDNO：13)，并且所述反义链包含5’-UGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA-3’(SEQIDNO：15)，其中所述有义链的基本上所有这些核苷酸和所述反义链的基本上所有这些核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述有义链被共轭到在3’-末端处附接的一个配体上，并且其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。51.一种能够抑制细胞中载脂蛋白C3(APOC3)的表达的双链RNAi试剂，其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含5...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·菲茨杰拉德，W·奎贝斯，J·巴特勒，S·威廉斯，A·利鲍，G·辛克尔，M·迈尔，S·米尔斯泰恩，S·库奇曼奇，M·玛诺哈兰，
申请(专利权)人：阿尔尼拉姆医药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US