一种密闭式慢病毒载体培养装置制造方法及图纸

一种密闭式慢病毒载体培养装置，由盒体、阀门、连接管、Q‑syte分隔膜密闭式无针接头、Luer‑Lock注射器、过滤器和密闭栓组成，盒体由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体外侧凹入形成矩形容积腔，在盒体的左右两侧有变截面圆柱状通道，通道内固定有母槽连接管，Luer‑Lock注射器的接头为螺旋接头；使用该培养装置前首先进行转导质粒、293T细胞和Huh7.5.1细胞的培养基、原代肝细胞培养基、原代肝细胞组织的制备；使用该培养装置培养得到慢病毒上清液，将慢病毒上清液转染原代肝细胞，培养一定天数后可得到慢病毒载体。

A closed lentiviral vector culture device

A closed type lentiviral vector culture device, comprising a box body, a valve, a connecting pipe, Q syte diaphragm closed needleless connector, Luer Lock, syringe filters and closed bolt, the box body comprises an upper box and a lower box piece piece tightly, on the box and lower box pieces are fixed on the rigid frame, upper box and a lower box sheet piece the center part to the outside of the box body to form recessed rectangular volume cavity, the left and right sides of the box body is tapered cylindrical channel, a trough connecting pipe is fixed inside the channel, Luer joint Lock injector for spiral joint; using the training device before the first transduction plasmid, 293T cells and Huh7.5.1 cells culture medium, primary hepatocyte culture medium, primary liver tissue preparation; using the culture device cultured lentivirus supernatant, transfected lentivirus supernatant of primary hepatocytes culture Lentiviral vectors can be obtained after a certain number of days.

【技术实现步骤摘要】
一种密闭式慢病毒载体培养装置
本技术涉及一种密闭式慢病毒载体培养装置。
技术介绍
哺乳动物蛋白质的转基因表达可能将正常的体细胞转化为肿瘤发生的状态，例如p53和Rb路径的失活会导致显负性p53蛋白(p53DD)的表达，一个激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)/细胞周期蛋白复合体(cyclinD1/CDK4R24C)与原癌基因的激活,Ras,和hTERT通路通过致癌的表达形式的原癌基因(c-MycT58A),H-Ras(H-RasG12V)和hTERT,可以驱动不同的人类细胞转换致瘤的状态。研究报道称使用上述的致癌基因组合可以使正常细胞发生致癌状态，这表明正常的肝细胞可能用于基因工程以帮助研究发现在人体癌症的正常转化过程，当它回到宿主肝细胞中时可以形成肿瘤。慢性病毒载体可以转导不可复制细胞同时需要编码肿瘤细胞，细胞培养实验需要在生物安全等级为3级的密闭实验室中进行。然而目前的生物医学试验所使用的培养装置仍然不能很好的保护试验人员。
技术实现思路
为了解决目前技术中存在的问题，本技术提出了一种密闭式慢病毒载体培养装置，该装置为密闭系统，不会产生慢病毒气溶胶，液不会直接与慢病毒培养液接触，可有效保护试验人员，同时装置两个培养面均可培养细胞。为了实现上述技术目的，达到上述技术效果，本技术是通过以下技术方案实现的：一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，培养装置由盒体、阀门、连接管、Q-syte分隔膜密闭式无针接头、Luer-Lock注射器、过滤器和密闭栓组成；所述的盒体由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体外侧凹入形成矩形容积腔，在盒体的左右两侧各有一个变截面圆柱状通道，通道内固定有变截面圆柱状的母槽连接管；所述的Luer-Lock注射器的接头为螺旋接头。优选的，所述的上盒片和下盒片面积为25cm2，上盒片和下盒片为透气和透明的材料制成。本技术的有益效果是：提出了一种密闭式慢病毒载体培养装置和培养方法，该技术所用的装置可隔绝试验内部与外部的环境，不会产生慢病毒气溶胶，在密闭的培养环境中操作可避免与慢病毒培养液直接接触，可有效防止试验人员感染；同时提出的培养方法得到的慢病毒载体与传统培养方法得到的载体有相同的转导效率和转染效果。附图说明为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是密闭式慢病毒载体培养装置结构图；图2是所述的培养装置的部件连接示意图；图3是所述的两个培养装置的连接示意图；图4是3天后使用OCS系统和CCS系统进行培养后致癌基因编码LVs转导效率对比图，图中纵坐标为生物荧光酶活性，横坐标为不同的编码的致癌基因；图5是使用OCS系统和CCS系统转导PPH效果对比图，图中纵坐标为生物荧光酶活性；图6是缺失表达能力的质粒和正常的质粒感染PPH效果对比图；图7是注入慢病毒载体的小鼠在第0天、第2天和第6天的荧光素酶活性检测图。附图中，各标号所代表的部件列表如下：1-盒体，11-盒片，12-容积腔，13-母槽连接管，2-阀门，3-连接管，4-Q-syte接头，5-Luer-Lock注射器，6-过滤器，61-0.22um过滤器，62-0.45um过滤器，7-密闭栓。具体实施方式下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本技术保护的范围。请参阅图1-3所示，培养装置由盒体(1)、阀门(2)、连接管(3)、Q-syte分隔膜密闭式无针接头(4)、Luer-Lock注射器(5)、过滤器(6)和密闭栓(7)组成；盒体(1)由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体(1)外侧凹入形成矩形容积腔(12)，在盒体(1)的左右两侧各有一个变截面圆柱状通道，通道内固定有变截面圆柱状的母槽连接管(13)；Luer-Lock注射器(5)的接头为螺旋接头。试验步骤1、材料1.1试剂1.2装置1.2.1生物安全柜1.2.237℃和5％CO2的孵化器1.2.3水浴1.2.4倒置显微镜1.2.5-80℃冷冻器1.3细胞1.3.1293T细胞1.3.2原代肝细胞1.3.3Huh7.5.1细胞2、方法建立及注意事项2.1建模方式CCS系统由25cm2的盒片和连接装置组成，培养装置是一个紧密的细胞培养盒体，盒体由两个培养面组成，培养面固定在一个刚性框架上通过标准Luer-Lock连接口连接形成一个无菌的细胞培养腔体，培养表面是平的、透明的并具有透气性能。CCS系统用来培养293T细胞(LVs制品)和PPH(用于转导实验)，该系统与使用OCS系统在10cm2的Petri盘体上培养细胞类似。在OCS系统中慢性病毒(LVs)和PPH培养上层清液中存在的VSV-G-pseudotyped粒子可以使用Huh7.5.1细胞检测出来。只有在CCS系统中培养实施步骤才可以细化。2.2在CCS中管理液体转移由于培养系统是封闭的，通过使用注射器推拉相同体积的液体或气体把所有的液体(细胞悬浮、培养介质、LVs等)从一个腔体(注射器，培养装置)传输到另外一个腔体中。此外，在操作之前还需要检查所有的阀门是打开的，避免培养装置内部的气压过高，检查连接末端的插头为0.22um的过滤器或者Q-syte注射部位。为了注入液体，使用20mL的注射器吸入2mL气体然后吸入10mL液体制成一个空气存储注射器，这可以避免液体(尤其是细胞悬浮液)留在试管中。通过倾斜培养装置另一面注射和推吸试管中的泡沫可以将泡沫挤出培养装置。注射超过10mL的液体将会导致多余的液体残留在试管中。3.试剂制备3.1转导质粒的制备首先使用PCR对hTERT+p53DD、cyclinD1+CDK4R24C和c-mycT58A+HRasG12V进行增强处理，在CMVV5-LUC受体质粒上的XmaI和KpnI部位之间克隆三个插入序列，并对插入序列进行荧光素酶标记基因操作，得到荧光素标记的pLenti-hTERT+53DD、pLenti-cyclinD1+CDK4R24C和pLenti-c-mycT58A+HRasG12V质粒，使用荧光素酶pLenti-CMVV5作为控制荧光素酶报告基因的控制质粒；3.2293T细胞和Huh7.5.1细胞的细胞培养基(CM)制备向细胞培养基中添加体积比为10％的灭活胎牛血清，体积比为1％的非必需氨基酸，10ug/mL的庆大霉素；使用0.22um的过滤器(61)过滤后在4℃的环境中保存最多两个月；3.3原代肝细胞(PPH)培养基(WM)制备向500mL的William’sE培养基添加10mL的质量体积比为7.5％的牛血清蛋白，5mL的ITS-G，10-7M的地塞米松溶液，体积比为1％的非必需氨基酸，体积比为1％的青霉素和链霉素的混合溶液，体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密闭式慢病毒载体培养装置，其特征在于：培养装置由盒体(1)、阀门(2)、连接管(3)、Q‑syte分隔膜密闭式无针接头(4)、Luer‑Lock注射器(5)、过滤器(6)和密闭栓(7)组成；所述的盒体(1)由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体(1)外侧凹入形成矩形容积腔(12)，在盒体(1)的左右两侧各有一个变截面圆柱状通道，通道内固定有变截面圆柱状的母槽连接管(13)；所述的Luer‑Lock注射器(5)的接头为螺旋接头。

【技术特征摘要】
1.一种密闭式慢病毒载体培养装置，其特征在于：培养装置由盒体(1)、阀门(2)、连接管(3)、Q-syte分隔膜密闭式无针接头(4)、Luer-Lock注射器(5)、过滤器(6)和密闭栓(7)组成；所述的盒体(1)由上盒片和下盒片紧密贴合组成，上盒片和下盒片固定于刚性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒体(1)外侧...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，王志华，郑敏，赵辉，向东，张劲松，李珏，唐剑，王连敏，赵松凌，王琨，黄松泉，
申请(专利权)人：昆明医科大学第二附属医院，
类型：新型
国别省市：云南,53