一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用。本发明专利技术在大鲵虹彩病毒MCP蛋白天然表达基因基础上，依据杆状病毒表达系统对密码子的偏爱性进行了基因修饰，并通过优化表达条件显著提升了重组表达基因在杆状病毒表达系统中的表达效率。在此基础上，本发明专利技术应用免疫磁珠法对表达的目的蛋白进行纯化，该纯化方法具有很高的纯度和收率。本发明专利技术还公开了一种检测大鲵虹彩病毒抗体的ELISA检测试剂盒。

A preparation method of giant salamander iridovirus MCP antigen and its application

The invention discloses a preparation method of giant salamander iridovirus MCP antigen and its application. The natural expression of the proteins of the invention in the giant salamander iridovirus MCP gene based on baculovirus expression system based on preference of codon of gene modification, and by optimizing the expression conditions significantly enhance the expression efficiency of recombinant expression gene expression system in baculovirus. On the basis of this method, the expressed target protein was purified by immunomagnetic beads, and the purification method had high purity and yield. The invention also discloses a box ELISA kit for detecting antibody of giant salamander iridovirus.

【技术实现步骤摘要】
一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用。
技术介绍
中国大鲵(Chinesegiantsalamander，Andriasdavidianus)是现存个体最大的两栖动物，俗名“娃娃鱼”，是我国的珍贵特产，属于国家二级保护动物。近年来在我国的陕西、湖北、湖南、浙江、贵州等省份的大鲵主养区暴发了大鲵虹彩病毒病(Chinesegiantsalamanderiridovirusdisease，CGSIVD)，该病可感染各种规格的养殖大鲵，死亡率高达90％以上，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。大鲵虹彩病毒病的病原为大鲵虹彩病毒(Chinesegiantsalamanderiridovirus，CGSIV)，是虹彩病毒科(Iridoviridae)，蛙病毒属(Ranavirus)的成员。虹彩病毒(Iridoviruses)是一类病毒粒子较大，呈二十面体状的双链DNA病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)分为五个属：绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)，虹彩病毒属(Iridovirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，巨大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavirus)。虹彩病毒可感染无脊椎动物(绿虹彩病毒属，虹彩病毒属)及变温脊椎动物(蛙病毒属，淋巴囊肿病毒属，巨大细胞病毒属)，包括两栖类、爬行类、甲壳类、软体动物、昆虫及鱼类等。脊椎动物虹彩病毒，尤其是蛙病毒属的一些成员已经成为导致变温动物发病的一个重要原因。为有效防控CGSIV的流行，目前众多学者针对CGSIV建立多种诊断方法，如环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)检测方法、巢式PCR法等检测方法(刘星星，等.2014；Meng，etal.，2013)。但这些方法均是建立在PCR检测原理基础之上，或者易污染，结果假阳性率较高，或者需要的仪器设备较为昂贵，用时较长，现场使用不便利。实际生产和科研都亟需更为简便、快速的免疫学检测方法用于现场CGSIV的检测和筛查。血清学检测方法是病毒性疾病的主要免疫学方法。其中通过检测感染后机体产生特异性抗体可以及早对机体是否感染病毒做出较为准确的判断。研究表明，动物在感染虹彩病毒或接种相应病毒灭活疫苗最早一周之内，就可以检测到特异性的抗体(Maniero，etal.，2006；Liu，etal.，2014)。ELISA检测方法以其操作简便，检测样本量大等优点已经成为病毒血清学检测的主要手段。而在血清学检测方法的建立中，抗原的纯度和良好的抗原性是基础。主要衣壳蛋白(MajorCapsidProtein，MCP)是虹彩病毒的一个晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表达，编码核苷酸全长为1392bp，编码氨基酸为463个氨基酸残基，编码的主要衣壳蛋白分子量约为50kD，构成病毒的二十面体衣壳。比较虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列发现，虹彩病毒MCP基因的氨基酸序列是高度保守的，同一属的同源性一般在90％以上，不同属之间的同源性一般为40％-50％左右(Tidona，etal.，1998；Chinchar，etal，2011)。MCP能够诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，是制备虹彩病毒人工抗原的首选靶蛋白(Qin，etal.，2002；Li，etal.，2014；Liu，etal.，2015；Zhou，etal.，2015)。很多专利技术者针对各自虹彩病毒MCP制备人工抗原，但通过体外重组表达全长MCP作为人工抗原，因生产过程中MCP表达量少，导致制备成本增加。为此，多数学者通过对MCP进行截短表达，以期提高表达量。但这样，MCP的抗原性就会变得较差。再者，为便于后续蛋白的纯化，已有的研究往往在表达各自虹彩病毒MCP时加入各种商业化的标签，这样虽然纯化步骤较为简单，但在应用时又要切割掉标签，无形之中导致操作步骤繁琐。近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性和抗原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，已经在表达载体上占了主导的地位(Anderson，etal.，1995；Wang，etal.，2001)。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种重组杆状大鲵虹彩病毒的构建方法，包括如下步骤：S1、以CGSIV-LY分离株MCP基因序列(GenBankNo.KF023635)为原始模板，序列表见SEQIDNO.1；根据杆状病毒表达系统密码子的偏爱性人工合成CGSIVMCP基因的序列，修饰后的基因序列如SEQIDNO.2所示；根据人工修饰合成的MCP基因序列和杆状病毒穿梭载体pFastBac1所含的酶切位点，设计特异扩增引物，分别引入EcoRI、HindIII酶切位点，PCR扩增人工修饰MCP基因。引物序列如下：P1：5′-CCGGAATTCATGTCTTCTGTAACTGG-3′(EcoRI)；P2：5′-CCCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATCC-3′(HindIII)；总体积为50μL的反应体系为：0.5μL的T5U/μL的TaKaRaExTaq，5.0μL10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)，0.25nmol/LdNTPs4.0μL，引物50pmol/L各1.0μL，DNA模板1μL，ddH2O补充至50μL；反应条件为：95℃3min，95℃45s，60℃45s，72℃1min，30个循环，72℃充分延伸10min；10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，胶回收PCR产物；S2、将回收的人工修饰的MCP基因连接到pMD-18T载体，反应体系(总体积为10μL)：1μLpMD-18T载体、2μL回收的核酸片段、5μLddH2O、1μL10×LigaseBuffer、1μLT4DNALigase。充分混匀后，16℃低温水浴槽中连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞后过夜培养；菌落PCR方法检测目的片段是否连接到载体pMD-18T上；S3用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，分别用EcoRI和HindIII限制性内切酶双酶切pFastBac1载体和重组质粒，回收纯化后用T4DNA连接酶连接，再转化至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布含AMP(100mg/mL)的平板，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行酶切鉴定及测序，将鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac-MCP；S4、将重组质粒pFastBac-MCP转化E.coliDH10Bac感受态细胞，涂布三抗(Gen、Kan、Tet)、Bluo-gal、IPTG平板进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落三次划线纯化，经M13通用引物和MCP特异性引物PCR初步鉴定后，测序进一步鉴定，将确认结果正确的阳性重组转座子，命名为rBacmid-MCP；S5、通过碱裂解法提取rBacmid-MCP质粒，然后将2μg的rBacmid-MCP质粒与10μL转染试剂轻轻混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以CGSIV‑LY分离株MCP基因序列(GenBank No.KF023635)为原始模板，根据杆状病毒表达系统密码子的偏爱性人工合成CGSIV MCP基因的序列，修饰后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；根据人工修饰合成的MCP基因序列和杆状病毒穿梭载体pFastBac1所含的酶切位点，设计特异扩增引物，分别引入EcoR I、Hind III酶切位点，PCR扩增人工修饰MCP基因；引物序列如下：P1：5′‑CCG

【技术特征摘要】
1.一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以CGSIV-LY分离株MCP基因序列(GenBankNo.KF023635)为原始模板，根据杆状病毒表达系统密码子的偏爱性人工合成CGSIVMCP基因的序列，修饰后的基因序列如SEQIDNO.2所示；根据人工修饰合成的MCP基因序列和杆状病毒穿梭载体pFastBac1所含的酶切位点，设计特异扩增引物，分别引入EcoRI、HindIII酶切位点，PCR扩增人工修饰MCP基因；引物序列如下：P1：5′-CCGGAATTCATGTCTTCTGTAACTGG-3′(EcoRI)；P2：5′-CCCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATCC-3′(HindIII)；总体积为50μL的反应体系为：0.5μL的T5U/μL的TaKaRaExTaq，5.0μL10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)，0.25nmol/LdNTPs4.0μL，引物50pmol/L各1.0μL，DNA模板1μL，ddH2O补充至50μL；反应条件为：95℃3min，95℃45s，60℃45s，72℃1min，30个循环，72℃充分延伸10min；10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，胶回收PCR产物；S2、将回收的人工修饰的MCP基因连接到pMD-18T载体，反应体系(总体积为10μL)：1μLpMD-18T载体、2μL回收的核酸片段、5μLddH20、1μL10×LigaseBuffer、1μLT4DNALigase。充分混匀后，16℃低温水浴槽中连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞后过夜培养；菌落PCR方法检测目的片段是否连接到载体pMD-18T上；S3用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，分别用EcoRI和HindIII限制性内切酶双酶切pFastBac1载体和重组质粒，回收纯化后用T4DNA连接酶连接，再转化至E.coliDH5α感受态细...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小愿，张星朗，韩亚慧，贾秋红，高宏伟，
申请(专利权)人：陕西省水产研究所，
类型：发明
国别省市：陕西,61