鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系制造技术

本发明专利技术公开了鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系。本发明专利技术所提供的鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。本发明专利技术利用同源克隆技术克隆了类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT保守区段作为靶基因构建TRV2载体，成功建立了VIGS沉默体系，有效地降低了这两个基因的表达量和总花青苷含量。本发明专利技术结果对牡丹基因功能研究具有重要意义，也为解析牡丹色斑形成的分子机制奠定了基础。

VIGS silencing system for identification of flavonoid glycosyl transferase gene in Paeonia suffruticosa

The present invention discloses a VIGS silencing system for identifying peony flavonoid transferase genes. Contains the VIGS silencing system, the identification of peony ufgt gene inserted into the recombinant vector: gene silencing vector in VIGS; the gene sequence in the sequence table 1 shows the nucleotide sequence and / or in the sequence shown in sequence 3 nucleotide sequence. The present invention by homologous cloning techniques of flavonoid glycosyltransferase gene PsUF3GT and PsUF5GT conserved segment as target gene to construct TRV2 vector successfully established VIGS silencing system, effectively reduced the expression of these two genes and the total anthocyanin content. The results of this study have important significance for the study of peony gene function, and also lay the foundation for analyzing the molecular mechanism of peony mottling formation.

【技术实现步骤摘要】
鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系
本专利技术涉及生物
，特别涉及鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系。
技术介绍
牡丹(Paeoniasuffruticosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(SectionMoutan)落叶亚灌木，是我国传统名花。牡丹花色形成的化学基础研究较为深入，花瓣中含有12种花青苷，即天竺葵素3-葡萄糖苷(Pg3G)、天竺葵素3,5-二葡萄糖苷(Pg3G5G)、矢车菊素3-葡萄糖苷(Cy3G)、矢车菊素3,5-二葡萄糖苷(Cy3G5G)、芍药花素3-葡萄糖苷(Pn3G)、芍药花素3,5-二葡萄糖苷(Pn3G5G)、矢车菊素3,5-二己糖苷(Cy-3,5-di-hexoside)、矢车菊素3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷(Cy3G5Ara)、矢车菊素3-阿拉伯糖苷(Cy3Ara)、矢车菊素3-没食子酰葡萄糖苷(Cy3galloylG)；芍药花素3-阿拉伯糖苷(Pn3Ara)和芍药花素5-没食子酰葡萄糖苷(Pn5galloylG)，其中Pg3G、Pg3G5G、Cy3G、Cy3G5G、Pn3G和Pn3G5G是主要的花青苷(WangLS,ShiraishiA,HashimotoF,AokiN,ShimizuK,SakataY.2001.AnalysisofpetalanthocyaninstoinvestigateflowercolorationofZhongyuan(Chinese)andDaikonIsland(Japanese)treepeonycultivars.JPlantRes，114：33-43.；WangLS,HashimotoF,ShiraishiA,AokiN,LiJJ,SakataY.2004.ChemicaltaxonomyoftheXibeitreepeonyfromChinabyfloralpigmentation.JPlantRes，117：47-55.；李崇晖，2010.牡丹花瓣类黄酮成分分析及其对花色的影响，中国科学院植物研究所博士学位论文)，栽培品种尤其是西北牡丹品种群花瓣基部具有鲜艳、硕大的色斑，不仅增加了观赏价值，而且常作为品种分类的重要依据之一，这些非斑部分花青苷主要由Pn3G5G、Cy3G5G和Cy3G组成，Pn3G含量很低，几乎不含Pg型色素，推测花瓣基部Cy的糖苷化、甲基化和高含量是形成色斑的主要原因。Zhangetal.(2007)分析了35个西北牡丹品种花瓣的花青苷组成，斑中以Cy3G为主，非斑以Pn3G5G为主，斑中色素含量明显高于非斑中的色素含量(ZhangJJ,WangLS,ShuQY,LiuZA,LiCH,ZhangJ,WeiXL,TianDK.2007.Comparisonofanthocyaninsinnon-blotchesandblotchesofthepetalsofXibeitreepeony.SciHortic，114：104-111.)。可见花青苷的糖基化修饰在牡丹花色素的合成与积累过程中占有重要的地位(WangLS,ShiraishiA,HashimotoF,AokiN,ShimizuK,SakataY.2001.AnalysisofpetalanthocyaninstoinvestigateflowercolorationofZhongyuan(Chinese)andDaikonIsland(Japanese)treepeonycultivars.JPlantRes，114：33-43.)。类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物，通常需要在合成的最后一步进行糖苷化修饰，以增加其在细胞内的稳定性、溶解性并影响对花的显色(田鹏，刘占林.2011.糖基转移酶超家族[J].2011.生命的化学，31：732–736)。类黄酮糖苷化由糖基转移酶(UDP-glucose:flavonoidglycosyltransferases，UFGTs)完成，其糖基供体通常是核苷酸糖(nucleotidesugar,Uridinediphosphate,UDP)如UDP-葡萄糖等。最早发现的是控制玉米黑色素的基因Bronze1，其编码类黄酮UDP-糖基转移酶(DoonerHK,NelsonOE.1997.Controllingelement-inducedalterationsinUDPglucoseflavonoidglucosyltransferase,theenzymespecifiedbythebronzelocusinmaize.ProcNatlAcadSciUSA，74：5623-5627.)。之后，在很多植物中发现了类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)如玉米、金鱼草、龙胆和牵牛等的UF3GT(SchiefelbeinJW,RaboyV,FedoroffNV,NelsonJrOE.1985.Deletionswithinadefectivesuppressor-mutatorelementinmaizeaffectthefrequencyanddevelopmentaltimingofitsexcisionfromthebronzelocus.ProcNatlAcadSciUSA，82：4783-4787.)及龙胆和葡萄的UF5GT等(YangYZ,LabateJA,LiangZC,CousinsP,PrinsB,PreeceJE,AradhyaM,ZhongGY.2014.Multipleloss-of-function5-O-glucosyltransferaseallelesrevealedinVitisvinifera,butnotinotherVitisspecies.TheorApplGenet，127：2433-2451.)。此外，在月季中还有一种糖基转移酶先将花青苷5-O糖苷化后再继续将3-O修饰形成3,5-双-O-糖苷，聚类分析表明其与花青苷3GT-和5GT-糖基转移酶亚家族明显不同(OgataJ,KannoY,ItohY,TsugawaH,SuzukiM.2005.Plantbiochemistry:anthocyaninbiosynthesisinroses.Nature，435：757-758.；PurkayasthaA,DasguptaI.2009.Virus-inducedgenesilencing:Aversatiletoolfordiscoveryofgenefunctionsinplants[J].PlantPhysiolBiochem，47：967-976)，可见在不同物种中，类黄酮糖苷化修饰基因存在多样性并由超家族基因组成。牡丹花瓣中类黄酮(包括花青苷)合成途径中部分相关酶基因已有克隆和表达分析(DuH,WuJ,JiKX,ZengQY,BhuiyadMW,SuS,ShuQY,RenHX,LiuZA,WangLS.2015.MethylationmediatedbyananthocyaninO-methyltransferase,isinvolvedinpurpleflowercolorationinPaeonia.J本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系，其特征在于：包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系，其特征在于：包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。2.鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系，其特征在于：所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。3.权利要求2所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：(1)利用添加了BamHI酶切位点和XhoI酶切位点的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增，分别得到用于VIGS沉默的PsUF3GT靶片段、PsUF5GT靶片段；所述PsUF3GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增所述PsUF3GT靶片段的特异性引物如下：3GT-VF1：AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA；3GT-VR1：TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACTCCACCGTCG；所述PsUF5GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；扩增所述PsUF5GT靶片段的特异性引物如下：5GT-VF1：AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTGGTG；5GT-VR1：ACGCTCGAGTCACAAATCACCACCTTTCCCCACC；(2)用BamHI酶和XhoI酶将所述PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段和TRV2载体进行双酶切，酶切完成后将PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒庆艳，王亮生，朱瑾，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11