一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法，其主要是针对于幽门螺杆菌对抗生素的耐药性以及宿主药物代谢酶类型的检测。本方法主要包括：设计覆盖VacA、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，形成Primer Pool；提取宿主和幽门螺杆菌基因组进行扩增；进行PGM文库制备、纯化、定量、测序；计算出耐药比例和药物代谢酶类型。本发明专利技术利用多重PCR技术实现多位点的同时扩增，结合PGM测序，有利于指导临床关于幽门螺杆菌的检测和根除。

Method for guiding Helicobacter pylori eradication medication based on PGM high throughput sequencing technology

The invention provides a treatment method of PGM high-throughput sequencing technology guidance based on the eradication of Helicobacter pylori, which is mainly for the detection of Helicobacter pylori resistance to antibiotics and host drug metabolizing enzyme type. This method mainly includes: VacA, 23SrRNA, gyrA cover design, CYP2C19*2, gene specific primers for CYP2C19*3 testing region, the formation of Primer Pool; extraction of host and Helicobacter pylori genomic DNA; PGM library preparation, purification, quantification, sequencing; calculate the rates of drug resistance and drug metabolizing enzyme type. The invention utilizes multiplex PCR technology to realize simultaneous amplification of multi loci, and combines PGM sequencing to guide the detection and eradication of Helicobacter pylori in clinic.

【技术实现步骤摘要】
一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法
本专利技术涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种基于PGM高通量测序仪检测幽门螺杆菌特异性基因、幽门螺杆菌耐药基因和宿主药物代谢酶CYP2C19基因的方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(HelicobacterPylori，简称HP)是一种定植在胃粘膜上皮与粘液之间的革兰氏阴性螺旋状杆菌。自Marshall和Warren首次用微需氧技术分离出幽门螺杆菌后，人们相继发现幽门螺杆菌与慢性胃炎、消化道溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)密切相关，幽门螺杆菌感染也是胃癌发生的重要诱因之一。随着抗生素的广泛使用，幽门螺杆菌对抗生素的耐药性逐年增加，传统的幽门螺杆菌治疗方案的根除率也在降低。目前幽门螺杆菌根除治疗失败的原因包括抗生素的选择不当、患者依从性差和PPI代谢差异等，其中细菌耐药，尤其是克拉霉素耐药是最主要的原因。克拉霉素的耐药机制为细菌23SrRNA核苷酸可变区V区突变导致核糖体构象发生改变，使克拉霉素与幽门螺杆菌的亲和力降低，从而不能够有效的阻止细菌进行蛋白质合成，产生耐药性。常见的突变有A2142G、A2143G、A2143C，也有一些其他的突变A2115G、G2141A、T2117C、T2182C、T2289C、G2224A、C2245T、C2611A等，其中以A2143G最为常见。喹诺酮的耐药是由其作用靶位，革兰氏阴性菌的DNA旋转酶(由gyrA基因编码，负责DNA的裂解和重排)的变化导致的。当gyrA的喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)发生突变时，喹诺酮类药物不能与之结合，从而不能影响DNA的二级结构，产生细菌耐药性。常见的突变有Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr、Ala97Val四种，Asp86Asn较为少见，其中87和91突变在大多数的耐药菌株中均有发现，并且与高耐药性相关。有一项关于幽门螺杆菌的根除失败案例指出克拉霉素耐药是由患者体内占较少比例的克拉霉素耐药菌株导致的，目前还没有较好的检测方法来检测患者体内幽门螺杆菌的耐药和敏感菌株的比例。另一个影响幽门螺杆菌根除治疗的因素与细胞色素P450同工酶CYP2C19的基因多态性有关，该基因类型决定了人体对某些PPI代谢的快慢。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要有*1，*2，*3......*17，其中最为常见的是等位基因*2和*3。CYP2C19基因的多态性可分为强代谢者(extensivemetabolizer，EM)、中代谢者(Intermediatemetabolizer，IM)和弱代谢者(poormetabolizer，PM)。倘若对所有患者按照同一药物剂量治疗，不考虑其自身的代谢类型，可能会出现个体反应和药物毒副作用。因此，快速、准确地确定患者CYP2C19基因型及代谢类型，对选择针对性药物及剂量并展开及时的治疗干预是至关重要的。目前幽门螺杆菌的常用检测方法分为两大类：一类是侵入式检测方式，包括活组织切片染色法、快速尿素酶法、细菌培养法以及PCR的方法；另一类是非侵入式检测技术，包括13C或14C-尿素酶呼气试验、血清免疫学检验以及粪便抗原检测等。非侵入式检测技术虽然无痛、方便但是容易导致假阳性结果，特异性不高；侵入式检测技术中，细菌培养的方法是最准确的检测技术，被认为是诊断的“金标准”，但是具有检测周期较长，培养复杂，容易产生污染等问题。因此迫切需要一种快速检测幽门螺杆菌感染情况的方法。通过结合PGM测序，我们不仅可以很好的实现幽门螺杆菌耐药性和宿主药物代谢酶类型的检测，而且可以同时解决通量低的问题，非常适用于科学和临床检测。PGM测序仪主要的工作原理是通过DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中时释放出的一个H质子，导致局部pH值发生变化，这种变化被离子传感器检测到，使得化学信号转化为数字信号。该法是直接检测DNA合成，不需要扫描，摄像机，荧光等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种准确、快速、检测流程简单的方法，可以同时检测幽门螺杆菌特异性、耐药基因和宿主CYP2C19基因多态性位点，并能够更加科学、安全、快速、准确指导幽门螺杆菌感染患者的用药。为实现以上目的，设计覆盖VacA、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，扩增产物在180-220bp。进一步的，将各正向引物的5’端加上GCGTGTCTCCGACTCAG-bracode-GAT-特异引物，各反向引物5’端加上CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-特异引物。进一步的，将5对引物按照特定的比例合并，形成PrimerPool。进一步的，裂解胃黏膜组织样本，同时提取宿主和幽门螺杆菌基因组。进一步的，利用PrimerPool扩增出待测样本耐药区域的扩增产物，并纯化。进一步的，使用通用引物：A端：生物素-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG，P1端：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT进行文库制备、纯化、定量；进一步的，通过OneTouch2仪器和相关试剂进行油包水扩增，再用IonTorrentPGM测序仪进行测序；对测序结果进行质控和分析，滤去接头等序列，比对耐药区域和药物代谢酶基因多态性位点，根据突变reads/未突变reads，计算出耐药比例和药物代谢酶类型。本方法只需要简单的对胃黏膜样本进行裂解处理，即可获得幽门螺杆菌和宿主的全基因组。设计出幽门螺杆菌的特异性、耐药和宿主药物代谢酶CYP2C19基因，利用多重PCR技术将这些待测片段在一个PCR反应中实现扩增，结合通用引物的扩增实现待测样本的文库构建，一次测序即可获得幽门螺杆菌感染情况、耐药情况及宿主药物代谢酶CYP2C19基因多态性类型。该方法设计合理、操作流程简单、检测结果快速、准确、通量极高，可以满足不同科研和临床的检测需求，有利于指导临床关于幽门螺杆菌的检测和根除，为幽门螺杆菌感染治疗提供分子基础。此外，本专利技术的方法配合使用LifeTechnologies公司的个体化基因测序仪IonTorrentPGM，此款测序仪相比较于其他测序仪具有更加简单、快速、经济、灵活的优势，整个建库流程1天即可，测序也只需要3小时，相对于其他测序平台更加快捷，还可以根据测序样本的多少，选择合适的芯片即可避免测序数据的浪费，操作空间相当灵活多变，非常适合科学研究和临床检测。附图说明图1是文库质控Agilent2100检测图图2是克拉霉素耐药位点分析图具体实施方式为了使相关领域的科研人员和临床工作人员能够更好的理解本专利技术方案，下面结合实施方式和附图予以详细说明。但本专利技术并不限于以下实施方式。实施例1设计覆盖VacA、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的特异性引物，扩增产物在180-220bp，具体见表1。表1基因待测区域的特异性引物在上述设计好的引物的正向引物5’端加上GCGTGTCTCCGACTCAG-bracode-GAT-特异引物，各反向引物5’端加上CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法，其特征在于，两步法扩增建库结合PGM测序，可检测幽门螺杆菌特异性基因、幽门螺杆菌耐药基因和宿主药物代谢酶CYP2C19基因。

【技术特征摘要】
1.一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法，其特征在于，两步法扩增建库结合PGM测序，可检测幽门螺杆菌特异性基因、幽门螺杆菌耐药基因和宿主药物代谢酶CYP2C19基因。2.如权利要求1所述，一种基于PGM高通量测序技术指导幽门螺杆菌根除用药的方法，其特征在于，设计覆盖VacA、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待测区域的第一步扩增特异引物，并在两端加上接头，其扩增产物在180-220bp。3.如权利要求2所述，将各正向引物的5’端加上GCGTGTCTCCGACTCAG-bracode-GAT，各反向引物5’端加上CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT，并将引物按照比例混合，形成PrimerPool。4.如权利要求3所述，PrimerPool中这些引物的混合比例为：23SrRNA∶CYP2C19*2∶CYP2C19*3∶gyrA∶VacA＝2∶1∶1∶1.2∶1.5。5.如权利要求1所述，一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨比特，许佩松，杨宁敏，
申请(专利权)人：杭州致远医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33