一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法。本发明专利技术的用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atoh1基因。所述PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。所述Atoh1基因为小鼠来源。本发明专利技术合成的纳米基因载体复合物入胞后，其上包被的HA具有良好的生物相容性和可降解性，体内降解后不产生附加的毒性；在转染过程中保护纳米基因复合物不被体液中的蛋白结合导致转染效率低下；本发明专利技术制备的复合物能有效实现内耳毛细胞的定向转染。

Nano gene carrier complex for directional transfection of inner ear hair cell and preparation method thereof

The invention relates to the technical field of biological medicine, in particular to a nano gene carrier complex used for directional transfection of inner ear hair cells, and a preparation method thereof. The invention relates to a nano gene carrier complex for directional transfection of inner ear hair cells, comprising a PEI vector modified by hyaluronic acid and an Atoh1 gene carried by the vector. The PEI carrier is a bPEI nanoparticle of 25kDa. The Atoh1 base is derived from mouse sources. The synthesized nano gene carrier complex in the cell, the coated HA has the compatibility and biodegradability of good biological degradation in vivo produces no additional toxicity; in the transfection process protection nano gene complexes are not incorporated in body fluids leads to inefficient protein transfection; directional transfection complex material prepared by the invention can effectively realize the inner hair cells.

【技术实现步骤摘要】
一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法。
技术介绍
感音神经性耳聋主要是由听觉感受器官—耳蜗的变性引起的。对人类颞骨解剖学研究发现，感音神经性耳聋可由耳蜗多种细胞类型的变性引起，其中，承担将声音信号转换为电信号的毛细胞病变，是目前针对感音神经性耳聋研究的核心问题之一。以往，研究者们认为在哺乳动物体内，耳蜗毛细胞损伤变性后是不可再生的。近年来，有研究发现将包含毛细胞分化的关键基因---Atoh1基因的质粒导入体外培养的Corti器中，可以产生异位的毛细胞，本研究小组前期，利用腺病毒作为载体将Atoh1基因成功介导转染至噪声性聋的豚鼠耳蜗内，发现噪声损伤的豚鼠耳蜗过表达Atoh1基因，可使受损耳蜗内产生大量新的内外毛细胞纤毛簇，促进听功能的恢复。既往关于将Atoh1基因及其同源基因转入内耳的研究采用的基因载体大多为病毒类基因载体---腺病毒等。目前，常见的基因载体有病毒载体和非病毒载体两大类。腺病毒载体属于病毒载体的一种，具有较高的转染效率，目前被广泛应用。但病毒载体存在明显的缺点，如可能诱导宿主免疫反应、存在潜在致癌性，制备条件复杂，细胞转染缺乏特异性，且病毒载体所能装载的外源DNA大小相对有限。此外，病毒载体导致的宿主基因重组是限制其临床应用的另一个安全隐患。因此，针对病毒载体的上述缺点，我们转向非病毒载体的研究。非病毒制备简单，载基因容量大，且不会诱发宿主的免疫反应。而纳米颗粒又由于具备较高转染效率及特异性靶向作用，以及部分可生物降解性、低毒性、无免疫原性等特点，是理想的基因载体选择。其中，阳离子聚合物载体具有良好的结合和保护DNA的能力，易制备成纳米颗粒，能较易实现生物靶向性及生物适用性改造，是目前基因非病毒载体的一个重要研究对象。既往关于内耳非病毒基因载体的研究发现了数个能实现有效内耳基因转染的阳离子聚合物纳米颗粒载体，如WuN等研制了一种基于PAMAM的羧甲基β-环糊精分子修饰聚酰胺胺纳米载体携带Atoh1基因，通过圆窗膜途径将复合物导入内耳，术后7天发现内毛细胞的转染效率可达47.57±6.68％，外毛细胞的转染效率则可高达82.14±9.67％，实现了Atoh1基因向大鼠耳蜗的成功递送。但PAMAM衍生物合成过程复杂，制备过程可控性较差，合成产物稳定性不佳，因此无法进行进一步的推广，且既往的内耳转染研究均未报道能实现针对于毛细胞的定向转染。因此，我们选择了聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)。PEI是目前最热门的非病毒基因载体材料之一，也是目前最为广泛研究的阳离子聚合物基因载体材料，在体外具有较高的转染效率。在结构上，PEI可分为直链型(linearPolyetherimide,lPEI)和分支型(branchedPolyetherimide,bPEI)两种结构。以往大部分的实验研究均采用分支型PEI，其内含有大量的伯仲叔三种氨基，质子缓冲区间大，即具有独特的“质子海绵效应”，在PEI-DNA纳米复合物通过内吞作用进入细胞后，在溶酶体内逐渐累积，致使溶酶体的渗透性逐渐增强，在无需溶酶体溶解肽辅助作用下即可使溶酶体破裂，释放内吞的DNA至胞质。然而，PEI等合成型阳离子聚合物都有一定的毒性，其基因转染效率和毒性与其分子量有关。高分子量的PEI(如25kDaPEI)，带有较多的正电荷，因此具备较高的结合DNA的能力，而具有较高的转染效率，但因PEI在体内不可降解，因此过高的电荷密度也导致较大的细胞毒性，在体内应用受到限制。低分子量PEI(如<2kDaPEI)毒性较小，但所带的正电荷也少，不能有效结合及完全包裹DNA，载体稳定性差，转染效率也不高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的问题，提供一种新的纳米基因载体复合物及其制备方法，该方法合成过程易操作、稳定性强、可实现内耳毛细胞的定向转染，达到治疗受损毛细胞的目的。本专利技术为了解决上述技术问题，所采取的技术方案为：本专利技术提供了一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其中，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atol1基因。作为优选地，本专利技术所述的PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。本专利技术选择的目的基因为可以任意动物的来源的Atoh1基因，例如，小鼠、大鼠、兔和猪等动物的Atoh1基因以及人的Atoh1基因，具体来源根据实际需要选择。作为标记，可以选择将所述Atol1基因携带EGFP，也可以携带其它基因标记物。本专利技术的用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物的制备方法，包括以下步骤：1)纳米基因复合物的制备：将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中，获得PEI/Atoh1复合物；2)纳米基因复合物的修饰：将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中，反应后即获得纳米基因复合物。根据本专利技术的纳米基因复合物制备方法，其中优选地，步骤1)按照N/P＝10:1将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中。具体地，Atoh1质粒溶解于充分灭菌的无酶去离子水中(去离子水的用量可以参照常规操作，达到充分溶解即可)，保持溶液pH＝7.2-7.6。步骤1)将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。根据本专利技术的纳米基因复合物制备方法，其中优选地，步骤2)按照COOH/N/P＝4:10:1将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中。步骤2)将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。根据本专利技术，加入质粒后所有的反应前的混匀都通过移液器轻柔反复吹打，为预防Atoh1质粒被破坏，不采用涡旋的方式，而优先选择吹打方式。PEI纳米颗粒与Atoh1质粒混匀后，通过静电结合力，PEI上的阳离子结合Atoh1质粒上的阴离子，形成一个纳米球。但其表面还有许多能导致细胞毒性的阳离子，通过将这些带阳离子的纳米球置入带负电荷的HA溶液中，前者表面的阳离子可与HA相结合，被HA包被起来。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1)本专利技术合成的纳米基因载体复合物入胞后，其上包被的HA具有良好的生物相容性和可降解性，体内降解后不产生附加的毒性；2)本专利技术利用HA修饰PEI/Atoh1复合物，中和了PEI/Atoh1复合物表面的阳离子，在转染过程中保护纳米基因复合物不被体液中的蛋白结合导致转染效率低下；3)本专利技术利用HA修饰PEI/Atoh1复合物，中和了PEI/Atoh1复合物表面能导致细胞毒性的阳离子，在入胞过程中，大大减少了阳离子与细胞膜上蛋白结合导致的细胞毒性；4)本专利技术制备的HA/PEI/Atoh1复合物能有效实现内耳毛细胞的定向转染，准确将目的基因转染至需要治疗的毛细胞，避免其他细胞的摄取导致的转染效率低下，更有效地实现毛细胞纤毛损伤后的修复。5)本专利技术的制备工艺简单，制备过程易于控制、生产效率高、稳定性佳，成本低。附图说明图1为本专利技术的纳米基因载体合成过程示意图。图2为实施例1中PEI/Atho1纳米复合物颗粒的电镜下形态。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atoh1基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atoh1基因。2.根据权利要求1所述的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述Atoh1基因为小鼠来源。4.一种权利要求1-3任一所述纳米基因载体复合物的制备方法，包括以下步骤：1)纳米基因载体复合物的制备：将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中，获得PEI/Atoh1复合物；2)纳米基因复合物的修饰：将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中，反应后即获得纳米基因复...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴南，杨仕明，王方园，邓雄威，吴雁，陈志婷，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11