重组大肠杆菌的构建方法及发酵生产β‑丙氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：敲除大肠杆菌中天冬氨酸激酶的编码基因lysC、泛酸合成酶的编码基因panC和葡萄糖转运蛋白EⅡCBGlc的编码基因ptsG，并用PL启动子过表达panD基因，得到重组大肠杆菌。本发明专利技术还提供了上述方法构建的重组大肠杆菌发酵生产β‑丙氨酸的方法。本发明专利技术构建的重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中进行上罐补料发酵，其β‑丙氨酸的产量可高达18.4g/L，生产强度达到0.61g/L·h，而未经本发明专利技术的方法改造的大肠杆菌B0016‑050的β‑丙氨酸的产量仅为5.2mg/L。

The construction method of producing beta alanine method and fermentation of recombinant Escherichia coli

The invention relates to a construction method of recombinant Escherichia coli, which comprises the following steps: the ptsG gene encoding on panC and glucose transporter gene encoding E protein encoding genes lysC and CBGlc in Escherichia coli aspartate kinase pantothenate synthetase II, and PL promoter of panD gene expression by recombinant Escherichia coli. The invention also provides a method for the construction method of the fermentation of recombinant Escherichia coli producing beta alanine. The construction of recombinant Escherichia coli were cultured on the tank fermentation medium in inorganic salt modified, the beta alanine yield can be as high as 18.4g/L, the production strength reached 0.61g/L h, and the production method of the invention without the transformation of Escherichia coli B0016 050 beta alanine is only 5.2mg/L.

【技术实现步骤摘要】
重组大肠杆菌的构建方法及发酵生产β-丙氨酸的方法
本专利技术涉及微生物发酵工程
，尤其涉及一种重组大肠杆菌的构建方法及发酵生产β-丙氨酸的方法。
技术介绍
β-丙氨酸在医药食品化工等领域都有着广泛的应用，尤其是其可作为具有高附加值的医药中间体。目前在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法或β-氨基丙腈水解法，这些方法多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题。近年来越来越多的人开始研究酶转化法生产β-丙氨酸，但也存在一些问题，如高浓度底物对菌的生长产生抑制，产物的产率较低、分离纯化的成本较高等。而微生物发酵法具有原料成本低，反应条件温和，容易实现大规模生产等优点。但目前国内尚未出现有关发酵生产β-丙氨酸的方法。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种重组大肠杆菌的构建方法及发酵生产β-丙氨酸的方法，本专利技术构建的重组大肠杆菌本专利技术对大肠杆菌代谢途径进行改造，降低其副产物合成量，高效表达β-丙氨酸合成代谢途径，通过发酵法高效生产β-丙氨酸，采用本专利技术的方法所构建的重组大肠杆菌，其β-丙氨酸的产量可高达18.4g/L，生产强度达到0.61g/L·h，而未经本专利技术的方法改造的大肠杆菌B0016-050的β-丙氨酸的产量仅为5.2mg/L。在一方面，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：敲除大肠杆菌中天冬氨酸激酶的编码基因lysC、泛酸合成酶的编码基因panC和葡萄糖转运蛋白EⅡCBGlc的编码基因ptsG，并用强启动子过表达panD基因，得到所述重组大肠杆菌。其中，lysC的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；panC的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；ptsG的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；panD的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。进一步地，大肠杆菌为敲除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸、醇合成途径编码基因的重组菌株。使用敲除了上述有机酸和醇代谢途径编码基因的重组菌作为出发菌株，可以在后续发酵过程中降低乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸、醇等副产物。进一步地，大肠杆菌为大肠杆菌B0016-050。进一步地，强启动子为PL启动子、Ptac启动子或Ptrc启动子。进一步地，panD基因来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum或赤拟谷盗Triboliumcastaneum。在另一方面，本专利技术还提供了一种采用上述构建方法得到的重组大肠杆菌摇瓶发酵生产β-丙氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将重组大肠杆菌的LB种子培养液接种至无机盐培养基中，使得OD600＝0.05-0.8，在28-37℃下培养至OD600＝1.5-4.5；(2)然后向无机盐培养基中补加浓度为25-75g/L的甘油1-40mL/L，在40-45℃下进行诱导培养，诱导培养过程中使用碳酸氢盐控制pH＝6-7.5。进一步地，在步骤(1)中，将重组大肠杆菌在LB种子培养基中培养获得LB种子培养液。进一步地，在步骤(1)和步骤(2)中，在步骤(1)和步骤(2)中，在转速为150-220r/min的条件下振荡培养。进一步地，在步骤(2)中，在步骤(2)中，向无机盐培养基中每隔2-8h补加浓度为25-75g/L的甘油水溶液。优选地，每升无机盐培养基中补加30mL浓度为63g/L的甘油水溶液。甘油作为重组大肠杆菌生长过程中的碳源。进一步地，在步骤(2)中，培养时间为30-65h。优选的，培养时间为42h。优选地，在步骤(2)中，使用浓度为100g/L的NaHCO3水溶液控制pH＝7。本专利技术还提供了一种采用上述构建方法得到的重组大肠杆菌发酵罐发酵生产β-丙氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将重组大肠杆菌在LB液体培养基中，于28-37℃下培养至OD600＝1.5-4.5，然后接种至浓度为0.1-2g/L甘油的无机盐培养基中，于28-37℃下培养至OD600＝3-5；(2)将步骤(1)得到的发酵液接种至无机盐培养基中进行上罐发酵，上罐发酵时甘油的初始浓度为5-40g/L，当培养至OD600＝10-50时，在40-45℃下进行补料发酵培养，并补加甘油和硫酸铵，补料发酵培养过程中使用碳酸氢盐控制pH＝6-7.5。进一步地，在步骤(1)之前，还包括将重组大肠杆菌在含有氨苄青霉素的LB平板上于33℃培养24h，然后转接于LB液体培养基中的步骤。进一步地，在步骤(1)中，以2.5％(v/v)的接种量接种至无机盐培养基中。进一步地，在步骤(1)和步骤(2)中，在转速为100-1000r/min的条件下进行培养。优选地，在步骤(2)中，使用浓度为100g/L的NaHCO3水溶液控制pH＝7。进一步地，在步骤(2)中，每隔6h，每升发酵罐中补加6.5-26g甘油和2-8g硫酸铵。进一步地，在步骤(2)中，补料发酵培养过程中的溶氧大于45％，总发酵时间为30-65h。优选的，发酵时间为42h。在本专利技术的发酵生产β-丙氨酸的方法中，在步骤(2)中，所用碳酸氢盐为NaHCO3或KHCO3。在本专利技术的发酵生产β-丙氨酸的方法中，无机盐培养基中包括硫酸铵和甘油。进一步地，每升无机盐培养基中包含以下含量的各组分：NaHPO4·12H2O7.5-20g、KH2PO41-5g、NH4Cl0.1-5g、NaCl0.1-3g、(NH4)2SO41-20g、甘油添加至指定浓度、泛酸0.1-1g、MgSO40.1-1g、氨苄青霉素50-100μg以及微量元素母液1mL；其中，每升所述微量元素母液中含有以下重量的各组分：FeCl3·6H2O2.4g；CoCl2·6H2O0.3g；CuCl2·2H2O0.15g；ZnCl20.3g；Na2MO4·2H2O0.3g；H3BO30.075g；MnCl2·4H2O0.495g。无机盐培养基中，以甘油为唯一碳源，目的是在代谢过程中产生更多的还原力，优点是可促进β-丙氨酸发酵合成；在无机盐培养基中添加高浓度(NH4)2SO4，目的是提供更多的NH4+，可促进β-丙氨酸发酵合成。本专利技术中，大肠杆菌B0016-050(EscherichiacoliCICIMB0016-050)为文献“周丽等，微生物学通报，2015，42(11)：2272-2281”中公开的大肠杆菌。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：在敲除了副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因(ackA-ptapflBadhEfrdAldhA)的EscherichiacoliCICIMB0016-050菌株中，叠加敲除β-丙氨酸的竞争途径的酶的编码基因，并过表达来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum的panD基因，所构建的重组大肠杆菌的β-丙氨酸合成量大幅提高。在发酵过程中，使用改良的无机盐培养基，避免了复杂碳氮源来源和批次差异导致的发酵生产不稳定，营养成分简单可方便产品分离纯化，培养基廉价有助于降低生产成本以甘油为唯一碳源可在代谢过程中产生更多的还原力，添加高浓度(NH4)2SO4可提供更多的NH4+促进β-丙氨酸合成；使用两阶段控温，在摇瓶发酵和上罐补料发酵过程中，分别以菌体生长至OD600为1.5-4.5、10-50为分界点，将发酵温度由33℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：敲除大肠杆菌中天冬氨酸激酶的编码基因lysC、泛酸合成酶的编码基因panC和葡萄糖转运蛋白EⅡCBGlc的编码基因ptsG，并用强启动子过表达panD基因，得到所述重组大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：敲除大肠杆菌中天冬氨酸激酶的编码基因lysC、泛酸合成酶的编码基因panC和葡萄糖转运蛋白EⅡCBGlc的编码基因ptsG，并用强启动子过表达panD基因，得到所述重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌为敲除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸、醇合成途径编码基因的重组菌株。3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌B0016-050。4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述强启动子为PL启动子、Ptac启动子或Ptrc启动子。5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述panD基因来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum或赤拟谷盗Triboliumcastaneum。6.一种根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法得到的重组大肠杆菌发酵生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将所述重组大肠杆菌的种子培养液接种至无机盐培养基中，使得OD600＝0.05-0.8，在28-37℃下培养至OD600＝1.5-4.5；(2)然后向无机盐培养基中补加甘油，在40-45℃下进行诱导培养，诱导培养过程中使用碳酸氢盐控制pH＝6-7.5。7.根据权利要求6所述的生产β-丙氨酸的方法，其特征在于：在步骤(1)和步骤(2)中，在转速为150-220r/min的条件下振荡培养。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，梁姗姗，周丽，崔文璟，刘中美，郭军玲，张斌，苏雅芝，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32