一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，将Δ6‑去饱和酶重组到酵母菌的基因组中；所述酵母菌是粘红酵母，所述Δ6‑去饱和酶由刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到的。本发明专利技术还公开一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株的构建方法。本发明专利技术具有如下有益效果：经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；实现了D6D的稳定、长久表达；实时荧光定量PCR表明D6D的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的GLA较野生菌株提高了3.3倍多。

High yield unsaturated fatty acid recombinant engineering strain and construction method thereof

The invention relates to a high yield of unsaturated fatty acids in recombinant strains, the delta 6 desaturase recombined into the genome of yeast; the yeast Rhodotorula glutinis is, the delta 6 desaturase D6D gene isolated by Cunninghamella echinulata and amplified the. The invention also discloses a method for constructing a recombinant strain with high production of unsaturated fatty acid. The invention has the following advantages: after double enzyme digestion, the recombinant plasmid fragment was inserted into the right direction; D6D realize the stable and long expression; real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression level of D6D was increased by 2 times; the analysis of gas chromatography, the transformation strain GLA increased by 3.3 compared with the wild strain many times.

【技术实现步骤摘要】
一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株及其构建方法。
技术介绍
许多不饱和脂肪酸因其广泛的生理活性和其在人类健康、营养方面的重要作用越来越受人们关注；多肽药物又因其半衰期短、易被酶降解而限制了应用。微生物油脂的合成过程与动植物几乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有两种胞质酶系催化，乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合酶复合体，以乙酰CoA为碳源经过多次碳链延长合成饱和脂肪酸，或再经过去饱和作用合成不饱和脂肪酸。在去饱和过程中主要由各种去饱和酶负责催化，是合成长链不饱和脂肪酸的关键，能在脂肪酸碳链上引入C＝C双键，提高脂肪酸的不饱和度，酵母中广泛存在脂肪酸去饱和酶。而合成不饱和脂肪酸的酶分为两种，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去饱和酶。甲基定向的脂肪酸去饱和酶从甲基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为ω-去饱和酶；羧基定向的脂肪酸去饱和酶从羧基端固定的碳原子处引入碳碳双键，被称为Δ(delta)-去饱和酶，也称为“front-end”去饱和酶。Δ9-去饱和酶将第一个碳碳双键引入饱和脂肪酸中，第二个碳碳双键由Δ12和Δ6-去饱和酶负责引入，Δ15去饱和酶则负责引入第三个双键。在细胞合成18C饱和脂肪酸后，硬脂酸经硬脂酰-CoA去饱和酶去饱和得到油酸；油酸经Δ12-去饱和酶催化生成亚油酸，经Δ15-去饱和酶合成α-亚麻酸(ALA)；亚油酸经Δ6-去饱和酶催化生成γ-亚麻酸GLA。其中，Δ6-去饱和酶是GLA合成途径中的关键酶，第一次克隆出Δ6-去饱和酶是1993年从蓝藻中分离克隆得到的，第一次通过生物技术获得GLA是在1996年在土豆中表达蓝藻的Δ6-去饱和酶基因生产GLA。GLA在人体中进一步脱氢延长形成花生四烯酸(AA)、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质，对人体有重要生理意义，因而近年人们对Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究热度较高，也取得了较大进展。虽然已经有多篇报道表明，表达外源Δ6-脂肪酸脱氢酶在酵母中会使GLA含量增加，但是迄今为止，尚未出现利用基因工程构建可以高产γ-亚麻酸(GLA)的酵母菌菌株的报道。
技术实现思路
针对以上所述现有技术存在的不足，本专利技术的第一目的是提供一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株。本专利技术的第二目的是提供所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株的建方法。为解决上述的技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，将Δ6-去饱和酶(D6D)整合到工程菌的基因组中。优选的，所述工程菌可以是酵母菌，所述酵母菌是酿酒酵母。所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMMCC2.1445。优选的，所述酵母菌是粘红酵母。所述Δ6-去饱和酶(D6D)有刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到的。一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株构建方法,其包括的步骤如下：(1)表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提；(2)连接PGK1基因和D6D基因；(3)PGK1-D6D片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步骤如下：(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mLLB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μLSTET缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；(4)加入4mL新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8mL5％CTAB，用混合器混匀后，13000rpm离心5分钟，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体；(7)加入1.2MNaCl300mL，充分溶解沉淀物，再加入750mL的预冷乙醇，充分混匀后，13000rpm离心15分钟，弃上清液；(8)取1mL70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，13000rpm离心5min，弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥5-10min；(9)沉淀物溶于50mLTE缓冲液中，混合器混匀，于-20℃保存备用。连接PGK1基因和D6D基因的引物为：PGK1-BamHIprimer1：5′-CGCGGATCCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3′(BamHI)PGK1-XhoIprimer2：5′-TATCCGCTCGAGTGTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAGATGTCGCCTATTATT-3′(XhoI)D6D-XhoIprimer1：5′-TCTGCTTTCTTCGCTCCGCTCGAGATGTCAGGGCAAACTCGAG-3′(XhoI)D6D-XhoIprimer2：5′-CATGCCATGGATCATCTAAAACATCTTTTGAGAG-3′(NcoI)。工程菌与D6D基因片段的摩尔比要控制在1:3-10。所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株用于作为外源亲脂类分子、多肽或化合物的药物引入的运载体。所述高产不饱和脂肪酸重组工程菌株用于作为外源亲脂类分子、多肽或化合物的功能性食品引入人体的运载体。外源亲脂多肽药物可以是α-MSH或者多肽H22LP。H22LP是实验室前期筛选得到的广谱趋化因子受体US28拮抗肽。US28作为人类巨细胞病毒(HCMV)编码的4个七跨膜趋化因子受体之一，是一个广谱的CC类炎症趋化因子受体，在HCMV感染的细胞中对β趋化因子的结合和钙流信号诱导起重要作用。我们通过对US28进行跨膜结构域和结合模拟位的预测，寻找出其N端与趋化因子激动的部位，合成相应部位的多肽，最终筛选出能阻断US28与其对应的CC类趋化因子相互作用、具有更少免疫原性和更强活性以用来作为拮抗剂的小分子先导物H22LP，经前期实验证明H22LP可以通过直接与病毒颗粒作用来达到抑制HCMV的效果。本专利技术具有如下有益效果：成功构建了外源基因D6D表达载体pPGK1Z-rD-D6D，实现外源D6D基因在粘红酵母GM4菌株内的高效表达，经双酶切鉴定，重组质粒上的目的片段插入方向正确；将重组质粒导入粘红酵母中，经转化菌株PCR鉴定，重组质粒成功导入粘红酵母中并插入到粘红酵母的基因组中，实现了D6D的稳定、长久表达；实时荧光定量PCR表明D6D的表达水平提高了2倍左右；经气相色谱法分析，转化菌株中的GLA较野生菌株提高了3.3倍多。附图说明图1是粘红酵母整合表达载体pPGK1Z-rD-D6D的构建的技术路线图；图2是菌落形态图观察照片；图3是PGK1(A)和D6D(B)基因的PCR扩增条带图；图4是粘红酵母转化菌株GM4-D6D的插入片段D6D的PCR检测图(其中1、2、3道为重组菌株，4、5、6道为空载体菌株)；图5是重组质粒pPGK1Z-rD-D6D双酶切鉴定图(以pPGK1Z-rD做对照，其中1道为pPGK1Z-rD-D6D，2道为pPGK1Z-rD)；图6是粘红酵母D6D基因表达水平图。具体实施例为了更好地阐述本
技术实现思路
，下面用若干较佳的具体实施例进行说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，其特征在于：将Δ6‑去饱和酶基因重组到工程菌的基因组中。

【技术特征摘要】
2017.04.27 CN 20171028959841.一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，其特征在于：将Δ6-去饱和酶基因重组到工程菌的基因组中。2.根据权利要求1所述的一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，其特征在于：所述工程菌为酵母菌，所述酵母菌是酿酒酵母，所述酿酒酵母为CGMMCC2.1445。3.根据权利要求1所述的一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，其特征在于：所述酵母菌是粘红酵母。4.根据权利要求1所述的一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株，其特征在于：所述Δ6-去饱和酶由刺孢小克银汉霉的D6D基因的分离与扩增得到。5.据权利要求1所述的一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株的构建方法，其特征在于，其包括的步骤如下：(1)表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提；(2)连接PGK1基因和D6D基因；(3)PGK1-D6D片段与表达载体载体的双酶切反应、连接。6.根据权利要求5所述的一种高产不饱和脂肪酸重组工程菌株的构建方法，其特征在于：表达载体pPGK1Z-rD-ME的抽提的方法的步骤如下：(1)将含有pPGK1Z-rD质粒的大肠杆菌DH5α接种到装有5mLLB-amp培养基中，于37℃下250rpm振荡培养过夜；(2)吸取1.5mL过夜菌液于离心管中，4℃下12000rpm离心1分钟，弃上清；(3)用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将菌体沉淀悬浮于200μLSTET缓冲液中，用涡旋混合器充分混匀；(4)加入4mL新配制的溶菌酶溶液，混匀后于室温下静置5分钟；(5)用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45秒，取出后立刻12000rpm离心5分钟；(6)用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，利时雨，黄俊丽，贺凯，
申请(专利权)人：广州弘宝元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44