检测创伤弧菌的RPA‑IAC引物及方法技术

本发明专利技术提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了所述的引物对及内标扩增序列在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用；以及基于RPA‑IAC技术的检测创伤弧菌的方法。经实验证明，本发明专利技术的RPA‑IAC引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物并配合扩增内标建立的创伤弧菌的RPA‑IAC检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检疫具有指导意义。

RPA IAC primer and method for detection of Vibrio vulnificus

The present invention provides primers and internal standard amplified sequences, nucleotide sequences of the primers are shown to contain SEQ ID NO:1 nucleotide sequence and SEQ ID NO:2 shows the amplified sequence contains a nucleotide sequence of the SEQ ID NO:3 shown in the internal standard. The invention also provides a primer on the internal standard and application of amplified sequences in the preparation of auxiliary detection or detection of Vibrio vulnificus in products; and the method based on RPA IAC technology for detection of Vibrio vulnificus. The experiment proved that RPA IAC specific primers of the present invention, high sensitivity, short detection time, does not require special equipment and is suitable for a wide range, and is based on the RPA IAC detection method of the primers and amplified with an internal standard of Vibrio vulnificus is sensitive, accurate and simple and fast, has guiding significance for import export goods and quarantine.

【技术实现步骤摘要】
检测创伤弧菌的RPA-IAC引物及方法
本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
创伤弧菌是一种带有荚膜的革兰氏阴性嗜盐弧菌，在海水养殖的牡蛎、虾和蟹等贝类、甲壳类水生动物中分布广泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一。人在生吃或未经充分加工的海产品，以及通过皮肤创口接触海水入血均可感染，并在短时间内出现败血症"蜂窝组织炎"出血性大疤，半数以上患者可因多脏器功能衰竭而死亡，因此创伤弧菌又被称为“海洋中的无声杀手”。目前世界上大部分沿海国家都有创伤弧菌的致病报道，我国江浙、闽粤沿海以及台湾地区亦有较多的感染报道，更有数例因创伤弧菌感染引起的败血症患者，在3-4d内均出现腹腔内广泛性坏死、多器官功能衰竭而死亡的案例，是公众饮食健康的重大威胁之一，所以对创伤弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义。目前，对创伤弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等,而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素，常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度更是进行反复优化，以防止非特异性扩增，在这些条件的制约下选取的引物极易影响扩增的有效性和特异性。此外，荧光检测设备普遍售价偏高，也在一定程度上限制了这类检测方法的推广应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA-IAC技术的检测创伤弧菌的方法，本专利技术还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA引物及内标扩增序列和对应的检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:本专利技术第一方面提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。本专利技术第二方面提供了所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用；在一优选例中，所述制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为创伤弧菌的产品。本专利技术第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒。在一优选例中，所述的试剂盒还包括RPA恒温扩增试剂。在一优选例中，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂。在一优选例中，还包括DNA提取试剂。在一优选例中，所述DNA提取试剂包括来自天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。在一优选例中，所述DNA提取试剂还包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。在一优选例中，还包括阳性对照和阴性对照。本专利技术第四方面提供了所述的试剂盒在检测或辅助检测创伤弧菌，或制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用。在一优选例中，所述检测或辅助检测创伤弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为创伤弧菌。在一优选例中，所述制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为创伤弧菌的产品。本专利技术第五方面提供了一种检测或辅助检测创伤弧菌的RPA-IAC方法，包括使用所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒或所述试剂盒的步骤。在一优选例中，所述检测或辅助检测创伤弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为创伤弧菌。在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：1)RPA-IAC扩增以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒或所述试剂盒进行RPA扩增。2)根据RPA-IAC扩增的结果判断生物样品是否感染创伤弧菌，或病原菌是否为或候选为创伤弧菌。任选的，在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤。在一优选例中，所述在生物样品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒或天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒进行。在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为234bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为334bp、234bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为生物样品感染创伤弧菌，或病原菌为或候选为创伤弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物只有大小为334bp的内标扩增片段，未含有大小为234bp的目标基因片段，则判定为生物样品未感染创伤弧菌，或病原菌不为或候选不为创伤弧菌；若所述RPA扩增得到的扩增产物未含有大小为334bp的内标扩增片段，未含有大小为234bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行检测。在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管再水化缓冲液29.5μLSEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L包含有SEQIDNO：3所示的内标扩增序列的质粒1.83×103copies模板DNA50ng醋酸镁溶液2.5μL，浓度为280mmol/L去离子水补足至50μL；在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。本专利技术第六方面提供了一种筛选创伤弧菌的系统，包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品或病原菌中的核酸样本；RPA-IAC扩增装置，所述RPA-IAC扩增装置与所述核酸提取装置相连，适用于所述的引物对或所述试剂盒对所述核酸样本进行RPA-IAC扩增；判断装置，所述判断装置与所述RPA-IAC扩增装置相连，以便基于RPA-IAC扩增的结果，判断所述生物样品是否感染创伤弧菌，或病原菌是否为或候选为创伤弧菌。在一优选例中，所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：含有冻干酶粉的0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用；任选的，所述制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为创伤弧菌的产品。3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA恒温扩增试剂；任选的，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂；任选的，还包括DNA提取试剂；任选的，所述DNA提取试剂包括来自天根生化科技有限公司的货号为DP432的动物基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。任选的，所述DNA提取试剂还包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂；任选的，还包括阳性对照和阴性对照。5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测或辅助检测创伤弧菌，或制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品中的应用；任选的，所述检测或辅助检测创伤弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为创伤弧菌；任选的，所述制备检测或辅助检测创伤弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为创伤弧菌的产品。6.一种检测或辅助检测创伤弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒或权利要求3-4中任一项所述试剂盒的步骤；任选的，所述检测或辅助检测创伤弧菌包括：检测或辅助检测生物样品是否感染创伤弧菌，以及检测或辅助检测病原菌是否为或候选为创伤弧菌。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)RPA-IAC扩增以生物样品或病原菌含有的DNA为模板与权利要求1所述的引...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌莉，周广彪，李志勇，魏霜，易敏英，王志强，刘婧文，胡科锋，黄成栋，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，汕头出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44