一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：(1)用去离子水将食源性低聚肽配制成溶液；(2)卷式超滤膜进行加压过滤；(3)收集滤液，喷雾干燥法进行干燥处理；(4)采用凝胶法检测产品细菌内毒素含量。最终制得的产品细菌内毒素含量＜50EU/g，食源性低聚肽回收率＞75％。本发明专利技术具有细菌内毒素去除率高、选择性好、超滤膜可反复使用、工艺稳定性强、过程简单、易于放大等优点，适用于多种食源性低聚肽的生产过程，为食源性低聚肽产品品质的提高提供了技术基础。

Method for removing bacterial endotoxin in food derived oligopeptide

The invention discloses a method for removing bacterial endotoxin in oligopeptides, which comprises the following steps: (1) the oligopeptides with deionized water to prepare solution; (2) volume type ultrafiltration membrane pressure filtration; (3) collecting filtrate, spray drying method and drying treatment; (4) by gel detection of bacterial endotoxin in products. Finally, the bacterial endotoxin content of the prepared product was less than 50EU/g, and the recovery rate of food derived oligopeptides was 75%. The invention has the advantages of high rate of bacterial endotoxin removal, good selectivity, ultrafiltration membrane can be used repeatedly, process stability, simple process, easy amplification, the production process for a variety of oligopeptides, provides the technical foundation for the improvement of the quality of products of oligopeptides.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法。
技术介绍
细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有结构，其本质为脂多糖(LipopolySaccharide，LPS)，在化学结构上主要由两部分组成，即多糖和类脂A，其中类脂A为活性中心。细菌内毒素在细菌生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡解体或粘附于其它细胞上时才表现出其毒性。细菌内毒素为主要的热原物质，微量的细菌内毒素进入人体循环系统就会引起发热、腹泻、血管扩张、休克、甚至死亡。食源性低聚肽为以动植物食物蛋白为原料，经生物酶水解、分离纯化等步骤得到的小分子肽类的混合物，可作为普通食品、保健食品、药品及细胞培养基的原材料。由于食源性低聚肽的生产原料来源广泛，无统一质量标准，并且食源性低聚肽为蛋白质酶解的产物，营养物质丰富，在加工及储藏过程中会有大量细菌繁殖，再加上加工辅料、生产环境、设备、操作等因素的影响，极易引起细菌内毒素污染。因而从上游原料及相应中间体的细菌内毒素指标极其不稳定，进而影响食源性低聚肽最终产品质量。食源性低聚肽可作为离体细胞生命活动所需营养物质及功能因子的来源，有效代替血清，用于细胞大规模培养及蛋白质药物、疫苗等生物制品的生产制备。由于各国药审部门对生物制品中的细菌内毒素含量均有严格规定，因此应对应用于生物制药领域的食源性低聚肽的细菌内毒素含量进行严格限制。此外，新生儿及婴儿的自身呼吸道、消化道屏障相对脆弱，较高水平的内毒素会导致高热、呼吸急促、心律不齐、心音低钝，血压下降、休克等现象，因此应严格控制应用于婴儿食品中的食源性低聚肽内毒素含量。为了得到质量稳定、安全性高的食源性低聚肽产品，开发一种生产成本低、可行有效、易于扩大的去除细菌内毒素的方法越来越重要。常用的去除细菌内毒素的方法包括活性炭吸附法、离子交换树脂法，酸碱化学处理法、热处理法、亲和层析法、超滤法等。食源性低聚肽属于生物活性物质，酸碱化学处理法及热处理法会破坏其结构和活性；活性炭吸附法选择性差、不易解吸、不易重复利用；离子交换树脂法及亲和层析等方法具有成本较高、处理量有限、生产不易扩大等缺点，因而均不适宜用于工业化水平的食源性低聚肽中细菌内毒素的去除；超滤法具有选择性好、易于重复利用、成本较低、处理量大等优点，是去除生物活性物质中细菌内毒素的合理选择。中国专利CN102631842A采用平均孔径为2～50nm的无机超滤膜去除大批量生物医药制剂中的细菌内毒素，去除效果好，并有效保留了制剂中的活性成分。中国专利CN102327605A公布了四价脑膜炎球菌多糖疫苗的制备工艺，其中涉及采用截留分子量为6000Da的超滤膜进行除细菌内毒素处理，保证了疫苗的纯度及活性，同时减少了工艺成本。中国专利CN102086234A在制备药用级中等分子量羟乙基淀粉的过程中，先后采用截留分子量为30万和10万的滤膜对料液进行超滤，能有效去除细菌内毒素，使产品内毒素含量符合国家药典规定。目前超滤法已广泛应用于医药制剂的生产中，而尚无报道采用此法去除食源性低聚肽中的细菌内毒素。细菌内毒素分子量从几千至数千万不等，而食源性低聚肽分子量90％以上均小于1000Da，二者之间存在很大差异，因此可选择合适孔径及材质的超滤膜将二者有效分离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术不足，提供一种利用卷式超滤膜去除食源性低聚肽中细菌内毒素的方法。该方法既能保证有效去除多种食源性低聚肽中的细菌内毒素，又能高效回收食源性低聚肽，并且具有选择性好、可重复使用、易于放大、生产成本低、工艺设计合理、不破坏食源性低聚肽结构及活性的优点。本专利技术是利用细菌内毒素和食源性低聚肽分子量之间的差异来设计的，通过以下技术方案来实现：一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：(1)用细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水将食源性低聚肽配制成浓度为0.15g/ml～0.3g/ml的溶液，其中溶液可采用磁力搅拌3～15min及超声波处理2～10min的方法加速其溶解；(2)待低聚肽充分溶解后，采用截留分子量为5000～13000Da的卷式超滤膜进行加压过滤，过膜压力为8～12psi；(3)收集滤液，并立即采用喷雾干燥法进行干燥处理，所得产品水分含量为1.5％～5％；(4)采用凝胶法检测产品细菌内毒素含量。最终制得的产品细菌内毒素含量＜50EU/g，食源性低聚肽回收率＞75％。上述步骤(1)中所述食源性低聚肽为玉米低聚肽、小麦低聚肽、大豆低聚肽、豌豆低聚肽、大米低聚肽、棉籽低聚肽等植物源低聚肽，或胶原低聚肽、乳清低聚肽、乌鸡低聚肽、牡蛎低聚肽等动物源低聚肽。根据不同低聚肽的溶解度不同，选择合适的溶液浓度。所述食源性低聚肽分子量低于1000Da的组分占90％以上，细菌内毒素含量＞200EU/g。上述步骤(2)中所述超滤膜材料为聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚砜(PS)等，在使用前后经细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水清洗，可循环使用。上述步骤(3)中所述喷雾干燥净化空气进口温度为120～180℃，出口温度为65～90℃。上述步骤中与食源性低聚肽溶液及粉末直接接触的器皿均去除细菌内毒素，所用方法为1M的NaOH溶液浸泡1小时以上后经细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水洗至中性，或250℃烘烤1h。上述步骤(4)中所述细菌内毒素测定采用特异性鲎试剂，排除(1，3)β-D-葡聚糖干扰，并同时做灵敏度复核实验及干扰实验，确保检测结果的可靠性。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的描述，但本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例1：一种除去玉米低聚肽中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：(1)玉米低聚肽原料细菌内毒素含量＞2×105EU/g，用细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水将其配制成浓度为0.22g/ml的溶液，并采用磁力搅拌7min及超声波处理5min的方法加速其溶解；(2)待玉米低聚肽充分溶解后，采用截留分子量为8000Da、材质为聚偏氟乙烯(PVDF)的卷式超滤膜进行加压过滤，过膜压力为10psi；(3)收集滤液，并立即采用喷雾干燥法进行干燥处理，喷雾干燥净化空气进口温度为150℃，出口温度为79℃，液体流速为220ml/h，所得产品水分含量为2.3％；(4)采用特异性凝胶鲎试剂法检测产品细菌内毒素含量。最终制得的产品细菌内毒素含量＜50EU/g，清除率＞99.9％，玉米低聚肽回收率为80.3％。上述步骤中与玉米低聚肽溶液及粉末本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：(1)用细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水将食源性低聚肽配制成浓度为0.15g/ml～0.3g/ml的溶液，磁力搅拌3～15min及超声波处理2～10min，加速其溶解；(2)待低聚肽充分溶解后，采用截留分子量为5000～13000Da的卷式超滤膜进行加压过滤，过膜压力为8～12psi；(3)收集滤液，并立即采用喷雾干燥法进行干燥处理；(4)采用凝胶法检测食源性低聚肽产品细菌内毒素含量。

【技术特征摘要】
1.一种除去食源性低聚肽中细菌内毒素的方法，其特征在于所述方法包括下述步骤：
(1)用细菌内毒素含量＜0.125EU/mL的去离子水将食源性低聚肽配制成浓度为0.15g/ml～0.3g/ml的溶液，
磁力搅拌3～15min及超声波处理2～10min，加速其溶解；
(2)待低聚肽充分溶解后，采用截留分子量为5000～13000Da的卷式超滤膜进行加压过滤，过膜压力为
8～12psi；
(3)收集滤液，并立即采用喷...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡木易，谷瑞增，林峰，刘艳，张海欣，易维学，鲁军，马勇，董哲，潘兴昌，马永庆，徐亚光，金振涛，陈亮，刘文颖，魏颖，陆路，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11