经修饰的DKK2蛋白、对其编码的核酸、其制备方法及其用途技术

根据一方面，提供经修饰的DKK2多肽、对其编码的核酸、其制备方法及其用途。因此，可以有效地制备具有额外糖基或对底物LRP6具有改善的结合亲和性的经修饰的DKK2蛋白质，从而用于促进血管生成或者预防或治疗血管通透性相关疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的DKK2蛋白、对其编码的核酸、其制备方法及其用途
本公开涉及一种添加有糖基或具有改善的结合亲和性的经修饰的DKK2蛋白、对其编码的核酸、其制备方法及其用途。
技术介绍
糖基化是糖与蛋白质连接的工艺，主要分为N-糖基化和O-糖基化。糖基化由糖基转移酶催化，并已经报道有约200种糖基转移酶。糖的种类和结构可能会影响蛋白质折叠、稳定性、溶解度和对蛋白酶的敏感性、血清半衰期、抗原性、活性增加等。DKK2是Wnt的阻遏蛋白，属于Dickkopf家族，并已经报道作为Wnt信号通路的抑制因子或刺激因子(WuW等,Curr.Biol.,10(24),第1611-1614页,2000)。DKK2可以包含两个特定的富含半胱氨酸的结构域(CRD)，并包括不同长度的连接区域。特别地，DKK2在具有10个半胱氨酸氨基酸的Dickkopf家族成员中高度保守半胱氨酸-2区域(KrupnikVE等,Gene,238(2),第301-313页,1999)。DKK2是在动物细胞中因低表达效率而难以产生的蛋白质，因此使用DKK2的治疗剂的开发正在延迟。因此，需要能够维持结合亲和性或对其底物具有改善的结合亲和性并且还表现出增加的表达效率的DKK2。
技术实现思路
问题的解决方案一方面，提供经修饰的DKK2多肽，其与野生型DKK2多肽的氨基酸序列相比，包含一个或多个额外糖基化位点。另一方面，提供编码经修饰的DKK2多肽的核酸。又另一方面，提供制备经修饰的DKK2多肽的方法。又另一方面，提供用于促进血管生成的药物组合物，所述组合物包含经修饰的DKK2多肽或编码经修饰的DKK2多肽的核酸、以及药学上可接受的载体。又另一方面，提供用于预防或治疗血管通透性相关疾病的药物组合物，所述组合物包括经修饰的DKK2多肽或编码经修饰的DKK2多肽的核酸、以及药学上可接受的载体。又另一方面，提供一种促进受试者的血管生成的方法，所述方法包括将经修饰的DKK2多肽或编码经修饰的DKK2多肽的核酸施用于所述受试者。又另一方面，提供一种预防或治疗受试者的血管通透性相关疾病的方法，所述方法包括将经修饰的DKK2多肽或编码经修饰的DKK2多肽的核酸施用于受试者。专利技术的有益效果根据一方面的经修饰的DKK2多肽、对其编码的核酸、其制备方法及其用途，可以有效制备具有额外糖基或对其底物LRP6具有改善的结合亲和性的经修饰的DKK2蛋白，从而被用于促进血管生成或用于预防或治疗血管通透性相关疾病。附图说明从以下结合附图对示例性实施方式的描述中，这些和/或其它方面将变得显而易见和更容易理解，其中：图1A和图1B分别是示出了含有各种标签的野生型DKK2蛋白和突变型DKK2蛋白的免疫印迹结果的图像，图1C是示出了含有Fc标签的DKK2N-Gly4和DKK2N-Gly5蛋白的免疫印迹结果的图像，图1D是示出了纯化蛋白质的电泳结果的图像。图2A和图2B是示出了突变型DKK2蛋白对各200ng的mLRP6和hLRP6在490nm处的吸光度的图，图2C和图2D是示出了DKK2蛋白对各100ng的mLRP6和hLRP6在490nm处的吸光度的图；图3A和图3B是示出了在施用试验材料后第14天和第21天施用突变型DKK2蛋白质的视网膜的荧光强度(％)的图；以及图4是示出了伊文思蓝血管通透性(％)根据施用DKK2蛋白质的图。具体实施方式一方面，提供了与野生型Dickkopf(DKK)2多肽的氨基酸序列相比包含一个或多个额外糖基化位点的经修饰的DKK2多肽。DKK2是指Dickkopf-2蛋白，也称为Dickkopf相关蛋白2、富含半胱氨酸的分泌蛋白2、CRSP2、CRISPY2或CRSP2蛋白。DKK2是一种在人类中由DKK2基因编码的蛋白质。该基因编码作为Dickkopf家族成员的蛋白质。已知DKK2是一种分泌蛋白质，含有两个富含半胱氨酸的区域，通过与Wnt信号通路的相互作用而参与胚胎发育。此外，它可以作为Wnt/β-连环蛋白信号传导的激动剂或拮抗剂，这取决于细胞情况和辅因子kremen2的存在。DKK2可以与低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)结合。野生型DKK2多肽可以是野生型DKK2前体多肽。野生型DKK2前体多肽可以是人类中具有基因库登录号为NP_055236.1的氨基酸序列(序列号1)的多肽或小鼠中具有基因库登录号为NP_064661.2的氨基酸序列的多肽。野生型DKK2前体多肽可以包括信号肽，并且信号肽可以通过共翻译修饰或翻译后修饰来切割。野生型DKK2多肽可以是成熟DKK2。成熟DKK2可以是包括通过从序列号1的氨基酸序列的N-末端去除位置1至33处的氨基酸序列(信号肽或前导肽)而得到的氨基酸序列的多肽，或包括序列号3的氨基酸序列的多肽。野生型DKK2前体多肽可以通过人类中具有基因库登录号为NM_014421的核苷酸序列(序列号4)的核酸以及小鼠中具有基因库登录号为NM_020265的核苷酸序列的核酸来编码。糖基化是指将糖基转移到蛋白质的反应。糖基化由糖基转移酶催化。糖基化可以是N-糖基化、O-糖基化、磷酸-丝氨酸糖基化、C-甘露糖基化、糖基磷脂酰肌醇化或其组合。N-糖基化是指糖分子与天冬酰胺的酰胺基团的连接。糖基化位点是指可以连接有糖分子或糖基的位点。例如，糖基化位点可以是Asn-Xaa-Ser/Thr的共有序列中的天冬酰胺残基(其是N-糖基化位点)。Asn表示天冬酰胺，Xaa表示除脯氨酸以外的氨基酸，Ser表示丝氨酸，Thr表示苏氨酸，Ser/Thr表示丝氨酸或苏氨酸。Asn-Xaa-Ser/Thr表示从N-末端起由天冬酰胺-氨基酸(不包括脯氨酸)-丝氨酸或氨基酸组成的多肽。糖分子与Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬酰胺连接。野生型DKK2前体多肽可以从N-末端在位置36处包括一个糖基化位点。经修饰的DKK2多肽的糖基化位点可以通过将天门冬酰胺(Asn，N)取代序列号3的氨基酸序列中选自由5I、31G、96P、110D、44P、2L、45C、57C、62Q、63G、85P、6K、98T、101I、11G、121H、135P、138K、151L、152R、166F、187K、203G、211D、213T和214Y组成的组中的一种或多种氨基酸而引入。数字表示从序列号3的氨基酸序列的N-末端起氨基酸所在的位置，并且字母字符表示氨基酸的1个字母代码。例如，‘5I’表示从序列号3的氨基酸序列的N-末端起位置5处的异亮氨酸。修饰可以是一个或多个氨基酸的取代。经修饰的DKK2多肽可以是DKK2多肽，其中通过引入糖基化位点而额外引入糖基。尽管经修饰的DKK2多肽可以在糖键、糖组成、糖基结构或其组合中变化，但糖基化发生在DKK2多肽的氨基酸序列的相同糖基化位点。作为结果，可以增加细胞内表达效率。例如，虽然经修饰的DKK2多肽可以在糖键(例如N-糖基化和O-糖基化)、糖组成(例如唾液酸化程度的差异)和糖基结构中根据宿主细胞(其中经修饰的DKK2多肽被表达)的种类而变化，但糖基化可以发生在DKK2多肽的相同糖基化位点。经修饰的DKK2多肽可以是包含一个或多个选自序列号5至30的氨基酸序列的多肽。标签可以进一步包含在经修饰的DKK2多肽的N-末端或C-末端。标签可以是连接到DKK2多肽的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的Dickkopf相关(DKK)2多肽，其与野生型DKK2多肽的氨基酸序列相比，包含一个或多个额外的糖基化位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.04 KR 10-2015-00174791.一种经修饰的Dickkopf相关(DKK)2多肽，其与野生型DKK2多肽的氨基酸序列相比，包含一个或多个额外的糖基化位点。2.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述野生型DKK2多肽包含序列号3的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述糖基化是N-糖基化。4.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述糖基化位点是Asn-Xaa-Ser/Thr，并且Xaa表示除脯氨酸以外的任何氨基酸。5.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述糖基化位点通过将天门冬酰胺(Asn，N)取代序列号3的氨基酸序列中选自由5I、31G、96P、110D、44P、2L、45C、57C、62Q、63G、85P、6K、98T、101I、11G、121H、135P、138K、151L、152R、166F、187K、203G、211D、213T和214Y组成的组中的一种或多种氨基酸而引入。6.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述经修饰的DKK2多肽包含一个或多个选自序列号5至30中的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，还包括在其N-末端或C-末端处的标签。8.根据权利要求7所述的经修饰的DKK2多肽，其中，所述标签是Fc(片段可结晶)区、多组氨酸肽或其组合。9.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，还包括在其N-末端处的信号肽。10.根据权利要求1所述的经修饰的DKK2多肽，其中，与所述野生型DKK2多肽相比，所述经修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：河一湖，刘爽镐，金惠暖，金应徹，林巨日，
申请(专利权)人：株式会社麦迪帕克特，
类型：发明
国别省市：韩国,KR