PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡及其制备方法，旨在提供一种操作方便，可以同时检测出低浓度和高浓度的PCT抗原，并且检测结果可靠的PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡；其技术要点，包括底板，所述的底板上依次衔接有样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，所述的结合垫喷涂有两种不同粒径荧光微球标记的PCT抗体，荧光微球标记的鸡IgY；所述的包被膜T线位置包被有抗PCT抗体，C线位置包被有羊抗鸡IgY；属于生物检测技术领域。

【技术实现步骤摘要】
PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡及其制备方法
本专利技术公开了一种检测卡，具体涉及一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，本专利技术还是涉及该PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡的制备方法。
技术介绍
降钙素原（Procalcitonin,PCT）是一个小分子蛋白，分子量约为13kDa，通常由甲状腺的C细胞产生。PCT现已被看作是伴随有全身性炎症和败血症的主要标志物。PCT由CALC-1基因编码，是降钙素的前体。PCT来源于降钙素原前体，后者由141个氨基酸组成，去除信号肽（1-25位氨基酸）后得到含有116个氨基酸残基的PCT，PCT经过连续的裂解，最终形成三个分子，分别是N端片段（N端PCT，57个氨基酸残基），降钙素（32个氨基酸残基）和抗钙素（21个氨基酸残基）。1993年，有报道发现PCT水平在细菌系统感染患者中有所升高（1）。经证实，与炎症相关的PCT并非由甲状腺C细胞产生，而是由所有薄壁组织和已分化类细胞产生（2-4）。PCT是一种很理想的细菌感染标志物，因为它在正常人中浓度非常低，而病毒性感染只会使PCT浓度略微升高。此外，PCT更重要的诊断价值在于它的浓度与炎症的严重程度密切相关。除了炎症或败血症能引起PCT升高外，手术、多处创伤、高温休克、烧伤和心源性休克有时同样可以导致PCT浓度的升高。此外，多项研究已证实心脏手术或心脏移植后PCT水平监测的重要性，PCT的改变可以用来鉴别急性排斥反应和由细菌或者真菌引起的感染。在正常及健康的个体中，其血清浓度极低，仅为10-50pg/mL，一般方法检测不到。在全身性细菌、真菌及寄生虫感染，系统炎症反应综合症、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者的血清PCT水平异常增高，其浓度比正常水平大几倍甚至上万倍；其在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排除反应等患者血清中的浓度不增高或轻微增高。这现象决定了PCT的高度特异性，因此可用于此类疾病的鉴别诊断，在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值，可广泛用于ICU病房、血液科、外科、内科、器官移植科、治疗实验室等。目前PCT在医院和血液系统广泛使用标记免疫分析技术是放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)，但在实际应用中存在以下缺陷：放射免疫分析的放射性核素污染；酶联免疫的酶的活性容易失活，酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构。免疫层析(LateralFlowImmunoassay，LFIA)技术是近几年来国内外兴起的一种快速诊断技术。LFIA以硝酸纤维素膜(NC膜)为载体，先将特异的抗体(抗原)固定于NC膜的某一区带，当膜条一端滴加样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体(抗原)的区域时，样品中相应的抗原(抗体)即与该抗体发生特异性结合，用免疫胶体金等染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。目前的LFIA快速检测试剂盒多以胶体金、彩色乳胶颗粒或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低、主要应用于定性或者半定量、批间差异较大等问题；基于彩色乳胶颗粒虽然批间差异有所改善，但灵敏度依然较低，也只能说明定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度得到很大提高，能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且stock位移较小，会对检测产生较大的影响。时间分辨荧光(Time-resolvedFluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通的荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。中国专利ZL201610031801.3公开了一种时间分辨荧光定量检测PCT的试剂盒，但是该试剂盒对荧光微球抗体复合物制备要求高，-80℃低温和需要冻干，检测灵敏度低，仅0.1ng/mL，并且只能仅检测血清，检测时间长，需要20分钟。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种操作方便，可以同时检测出低浓度和高浓度的PCT抗原，并且检测结果可靠的PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡。本专利技术的另外一个目的是提供上述检测试剂卡的制备方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，包括底板，所述的底板上依次衔接有样品垫、结合垫、包被膜和吸收垫，所述的结合垫喷涂有两种不同粒径荧光微球标记的PCT抗体，以及荧光微球标记的鸡IgY；所述的包被膜T线位置包被有抗PCT抗体，C线位置包被有羊抗鸡IgY。作为本专利技术的进一步优选，上述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，所述的两种不同粒径荧光微球是粒径为100nm荧光微球和300nm荧光微球。作为本专利技术的进一步优选，上述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，所述的粒径为100nm荧光微球和300nm荧光微球的比重为5:1~7:1。本专利技术提供的后一个技术方案为：一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡的制备方法，在底板上依次衔接有PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸，所述的结合垫采用下述方法依次制得的：1）制备100nm荧光微球标记抗PCT抗体在1mL0.1MpH6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒径的荧光微球和抗PCT抗体，两者比重为1:5~1:20；加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，室温反应30min，16000rpm离心30min，去上清，加入保存液，超声混匀；2）制备300nm荧光微球标记抗PCT抗体在1mL0.1MpH6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒径的荧光微球和抗PCT抗体，两者比重为1:10~1:50；加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，室温反应30min，16000rpm离心30min，去上清，加入保存液，超声混匀；3）制备荧光微球标记鸡IgY抗体在1mL0.1MpH6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中加入荧光微球和鸡IgY，两者比重为1:5~1:20；加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，室温反应30min。16000rpm离心30min，去上清，加入保存液，超声混匀；4）将上述步骤1）和步骤2）所制备的100nm、300nm粒径荧光微球按重量比5:1~7:1混合，混合后离心去上清，用添加了0.1%SDS、1%BSA和0.5%PEG20000的0.1M3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸复溶，得混合标记液，混合后的标记液与步骤3）荧光微球标记鸡IgY抗体按照重量比20:1混合，用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为3μL/cm，放入37℃烘箱，干燥8小时。进一步的，上述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡的制备方法，所述的包被膜的制备方法是反应膜上T线位置包被的是抗PCT抗体，C线位置包被的是羊抗鸡IgY。进一步的，上述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡的制备方法，所述的样品垫的制备方法将样品垫裁成20mm×300mm的大小，浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室温干燥16-18小时；所述的样品垫缓冲液配方如下：2%山梨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，包括底板（1），所述的底板（1）上依次衔接有样品垫（2）、结合垫（3）、包被膜（4）和吸收垫（5），其特征在于，所述的结合垫（3）喷涂有两种不同粒径荧光微球标记的PCT抗体，以及荧光微球标记的鸡IgY；所述的包被膜（4）T线位置包被有抗PCT抗体，C线位置包被有羊抗鸡IgY。

【技术特征摘要】
1.一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，包括底板（1），所述的底板（1）上依次衔接有样品垫（2）、结合垫（3）、包被膜（4）和吸收垫（5），其特征在于，所述的结合垫（3）喷涂有两种不同粒径荧光微球标记的PCT抗体，以及荧光微球标记的鸡IgY；所述的包被膜（4）T线位置包被有抗PCT抗体，C线位置包被有羊抗鸡IgY。2.根据权利要求1所述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的两种不同粒径荧光微球是粒径为100nm荧光微球和300nm荧光微球。3.根据权利要求1或2所述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡，其特征在于，所述的粒径为100nm荧光微球和300nm荧光微球的比重为5:1~7:1。4.制备权利要求所述的一种PCT荧光微球免疫层析检测试剂卡的方法，在底板上依次衔接有PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸，其特征在于，所述的结合垫采用下述方法依次制得的：1）制备100nm荧光微球标记抗PCT抗体在1mL0.1MpH6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒径的荧光微球和抗PCT抗体，两者比重为1:5~1:20；加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，室温反应30min，16000rpm离心30min，去上清，加入保存液，超声混匀；制备300nm荧光微球标记抗PCT抗体在1mL0.1MpH6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒径的荧光微球和抗PCT抗体，两者比重为1:10~1:50；加入10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，室温反应30min，16000rpm离心30min，去上清，加入保存液，超声混匀；制备荧光微球标...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤永平，叶向荣，张晓丽，李之华，潘秀华，
申请(专利权)人：广州市微米生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44